[发明专利]基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置

说明书

本发明公开一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学技术领域。本方法利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光，通过采用时空聚焦在样品中产生聚焦线、收集所激发荧光并采用共焦光学狭缝滤除杂散光、采集荧光光谱信息完成样品的光谱信息(x,λ)获取，最后由三维空间扫描与延时扫描获取样品(x,λ,y,z,t)五维信息。本装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的线扫描系统、光学显微系统、以及滤波与同步光谱共焦探测系统，且滤波与同步光谱共焦探测系统中的光谱信息获取与结合时空聚焦技术的线扫描系统中线扫描触发信号同步。本发明具有宽视场、高空间分辨率、高时间分辨率、高光谱分辨率等优点。

技术领域

本发明涉及一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置，属于显微光谱成像和分析化学技术领域。

背景技术

超光谱显微成像(Hyperspectral Microscopy)在生物医学研究领域有着重要应用，尤其是在临床疾病诊断、术中图像导航等领域日益受到人们的广泛重视。采用超光谱显微成像技术获取空间可分辨的光谱信息，可为疾病诊断提供生物组织的生理参数、形貌及组份等信息。目前，采用超光谱显微成像技术，已可实现对多种癌症的非侵入式检测。

从本质上讲，超光谱显微成像技术是在显微成像的基础上获取更高维信息(即光谱信息)的技术。依据显微成像技术的实现方式，当前的超光谱显微成像技术可分为基于普通宽场显微的超光谱显微成像技术、基于共聚焦扫描的超光谱显微成像技术等。前者可快速并行获取宽视场内的光谱信息，但限于普通宽场显微不具备层析能力、易受组织散射造成信号串扰等缺点，该技术仅适用于透明生物样本。后者基于共聚焦原理，一定程度上抑制了组织散射的影响且获得了轴向分辨能力，但由于需要进行逐点扫描成像，成像速度受到限制。此外，近年来还出现了基于光片显微的超光谱显微成像技术，遗憾的是该技术同样不适于散射性组织成像。

为了克服生物组织散射的影响并提高成像穿透深度，人们将非线性光学显微技术引入到超光谱显微成像中，发展了基于非线性光学效应的超光谱显微技术，并广泛应用于生物医学研究。由于普通非线性光学显微技术大多仍采用点扫描方式以克服组织散射的影响，成像的速度及通量势必受到影响。另一方面，采用面激发的非线性光学显微虽然免除了逐点扫描导致的速度瓶颈，但所激发信号经组织散射后串扰严重，不适于散射组织光谱成像。采用线扫描方式的普通非线性光学显微技术可以在成像速度与抑制散射影响二者之间折衷，但是该方法相对于点扫描方式所获得的轴向分辨率降低，亦非理想的选择。

因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够创新地提出一种有效措施，以解决现有技术中存在的不足。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术的不足之处，提供一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法及装置。本发明适用于散射性生物组织成像，可提高成像速度和通量，并具有高轴向分辨率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提出的一种基于时空聚焦的宽视场层析超光谱显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定沿激光光谱方向为λ轴，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，设定实现沿样品纵向线扫描的振镜偏转角步长，设定实现沿样品轴向扫描的显微物镜轴向步长，根据目标扫描区域的大小设定光谱信息采集周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法在样品中形成同时在空间及时间两个维度聚焦的聚焦线；

4)通过非线性光学效应在步骤3)的聚焦线上激发出荧光信号，该荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，然后由滤波片滤除反射的超短脉冲激光并由共焦光学狭缝滤除样品散射引起的杂散光，得到样品的条形发射荧光；