[发明专利]一种能够快速获得牙鲆稳转细胞系的载体

说明书

本发明提供了一种在牙鲆鱼中实现高效稳定转染的表达载体，本发明载体采用Tol2转座子，结合编码合成转座酶的质粒pCS‑TP共转染能够显著提高牙鲆鱼细胞整合外源基因的能力。发明载体添加了新霉素抗性筛选标记，从而实现了仅仅依靠传统的脂质体转染加抗性筛选的方式，即可获得较多的重组细胞，极大的提高了牙鲆鱼细胞筛选的到稳转细胞系的效率。发明载体添加了EGFP荧光标签，能够方便的示踪转入细胞系的外源基因的表达情况。更重要的，本发明载体采用优化后的牙鲆β‑actin启动子替代传统哺乳动物表达载体中常用的CMV启动子，创造性的获得了一种更适应牙鲆鱼细胞系外源基因表达的载体，从而实现外源基因在牙鲆鱼的各种细胞系中都能够高效稳定的表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能够快速获得牙鲆稳转细胞系的载体。

背景技术

细胞转染是将外源分子如RNA、DNA导入细胞的专门技术，现已经成为分子生物学和细胞生物学中研究基因功能常规手段。目前，细胞转染较为常用的方法有脂质体法、电穿孔法和病毒感染法。电穿孔法依靠瞬时的高脉冲的电压击穿细胞膜，从而将外源质粒导入到细胞内，适用范围广，但是操作上较为繁琐，且细胞转染后致死率较高，转染所需的细胞和DNA量较大，所以很少在细胞系转染的过程中适用。病毒感染法通过病毒携带DNA侵染细胞，进而将外源基因整合到宿主细胞的基因组上，能够实现细胞系的稳定转染，但是适用范围窄，对鱼类细胞系其转染效率底下，一时间很难筛选到适合鱼类细胞系转染的病毒，且成本较高，实验流程复杂。脂质体法的原理是通过带正电的脂质体与细胞膜上带负点的磷酸基团相互作用，形成复合体，引导外源基因导入细胞内，其适用范围广，转染效率高且操作简单。

目前，海洋鱼类细胞系的转染大多采用脂质体法实现外源基因的转染。但是，在利用脂质体法转染牙鲆鱼细胞的过程中仍然遇到以下问题：①外源基因转入牙鲆鱼细胞系后很难整合到细胞基因组DNA上，因而很难靠传统的脂质体转染后筛选的方式获得稳转染的牙鲆鱼细胞系。②成功转染进入牙鲆细胞的外源基因很难维持高效表达，绝大部分成功转染的牙鲆鱼细胞其外源基因的表达效率会在一周内消失殆尽，明显低于哺乳动物细胞转染后外源基因的表达效率。

分析原因主要是：①重组质粒转入牙鲆细胞后，随着筛选时间的延长，大部分重组质粒会随着细胞分裂而逐渐丢失，少部分保留的质粒也很难正确的整合到牙鲆细胞基因组上，这导致很难筛选到稳转的重组细胞系。②常用的哺乳动物表达载体上的CMV启动子并不能在牙鲆鱼细胞中高效、持久的启动下游基因的表达，表现为虽然初始启动效率较高，但随着时间的延长其启动效率逐渐降低。

受限于上述原因，长期以来，在利用牙鲆鱼的细胞系研究其基因功能的过程中一直采用脂质体瞬时转染的方式，而无法利用在哺乳动物细胞系中常用的稳转染方式，从而无法获得稳定转染外源基因的牙鲆鱼细胞系，极大地限制了在牙鲆中开展基因的调控的功能研究。因此，迫切需要一种高效获取牙鲆稳转细胞系的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速获得牙鲆稳转细胞系的载体，实现将转染至细胞内的外源基因高效的插入到牙鲆细胞系的基因组DNA中，并能够实现重组细胞的快速筛选。

本发明所提供的质粒载体，是带有Tol2转座子的DNA质粒载体，质粒载体中还携带有牙鲆特异性的β‐actin启动子和新霉素(G418)抗性筛选标记；

所述的牙鲆特异性的β‐actin启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

所述的质粒载体，还添加了EGFP荧光标签。

本发明所提供的质粒，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明再一个方面提供一种转染牙鲆细胞的方法，是使用上述的质粒载体将外源基因转染到牙鲆细胞内；

所述的方法，优选与结合编码合成转座酶的质粒pCS‐TP进行共转染；

所述的方法，其一种具体的步骤如下：