[发明专利]一种白藜芦醇合成白藜芦醇二聚体的生物催化方法

说明书

本发明公开了一种白藜芦醇合成白藜芦醇二聚体的生物催化方法。该生物催化方法是利用漆酶与Cu²⁺合成具有纳米级孔径和微米级尺寸的花状生物催化剂，在一定温度以及通入空气条件下进行催化合成。具体包括如下步骤：(1)利用酸酐对漆酶进行适当的化学修饰，然后利用Cu²⁺对修饰漆酶进行固定化得到花状纳米生物催化剂；(2)以白藜芦醇为底物，纳米花生物催化剂为催化剂，在一定温度下通入空气催化反应一段时间，经过滤、萃取、旋蒸得到白藜芦醇二聚体。本发明利用纳米花生物催化剂催化合成白藜芦醇二聚体的方法，该方法优点，缩短了反应时间，产物单一，产率达到41.0％远高于化学催化剂；纳米花生物催化剂可以循环使用，降低生产成本。

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技术领域

本发明涉及一种在一定温度下催化白藜芦醇合成白藜芦醇二聚体的生物催化方法，属于生物催化合成领域。

背景介绍：

漆酶作为一种生物酶，属于多铜氧化还原酶，能催化多种底物，而且反应条件较温和，副产物少，被称为“绿色催化剂”；但是，由于漆酶稳定性较差，易在高温、强酸、强碱等条件下失活，限制了其在工业上的应用；因此，提高漆酶的稳定性是实现其工业化的必要前提。

目前，大量的文献中提到对漆酶进行适当改性，主要有固定化和化学修饰两种方法。单纯的采用其中一种方法对酶进行改性，在提高稳定性的基础上往往会降低酶活性。本专利首次采用化学修饰与固定化相结合的方法，在漆酶结构不变的基础上保留原有的活性，利用硫酸铜对修饰后的漆酶进行固定化，合成纳米花状生物催化剂，增加了漆酶的比表面积、活性及稳定性，并应用于催化白藜芦醇合成白藜芦醇二聚体。

白藜芦醇(Resveratrol，C₁₄H₁₂O₃)为芪类化合物，是某些植物所产生的植物毒素，分布广泛，常见于葡萄科葡萄属、花生属以及虎杖等植物中。白藜芦醇可以通过体内代谢过程生成多种代谢产物。(二聚体的药理活性)其中，白藜芦醇二聚体(Viniferin)是过氧化物酶氧化白藜芦醇形成的，具有更强的生物活性，如：抗氧化、抗菌、抗HIV等。研究表明：抗氧化方面，Viniferin抑制COX-1和COX-2的作用要高于resveratrol；植物抗性方面，viniferin被认为是葡萄抵抗霜霉病的重要抗性标志；抗菌方面，viniferin对霜霉病菌的杀伤力很强；其他活性，viniferin相比于resveratrol对细胞色素酶P450具有更强的抑制作用，使其减少对香烟中惰性复合物的氧化，减少自由基的释放，以致于减少癌症的发生；其次，viniferin相比于resveratrol具有保护心血管和抗癌的潜在活性。目前主要利用化学仿生合成和生物合成白藜芦醇二聚体。化学仿生合成是通过使用无机或有机试剂(DPPH等)或金属盐(FeCl₃，AgOAC等)作为催化剂，以单体为底物进行化学反应。张元等利用AgOAC制备白藜芦醇二聚体，得到的产物中副产物种类较多，需要进行多次的分离纯化，增加了制备的步骤。生物合成是以酶(漆酶，辣根过氧化物酶，芪合物氧化酶等)为催化剂，以单体为底物通过氧化反应，脱氢聚合得到viniferin。Jian-Qiao Zhang等利用辣根过氧化物酶催化合成白藜芦醇二聚体，得率仅仅为13.5％。研究表明：两种合成方法的反应机理类似，漆酶首先使白藜芦醇脱氢形成自由基，自由基相互转化，形成醌式结构，然后再催化两分子的醌式结构白藜芦醇自由结合，从而形成白藜芦醇脱氢二聚体。然而，化学合成的方法存在一定的局限性，难以控制、反应时间长、得到的产物种类多、结构比较复杂、而且产率较低。生物合成法具有专一性高，易于控制，而且副产物少，环保的优点，但是游离酶稳定性较差，在有机溶剂中活性降低甚至失活。

为改善化学仿生合成与生物合成的方法，在本专利中，我们首次利用漆酶-无机盐合成的纳米花生物催化剂催化白藜芦醇合成白藜芦醇二聚体。通过对合成的产物进行MS以及¹H-NMR检测，得到的产物中只存在白藜芦醇二聚体，产物单一，得率达到41.0％；且反应时间大大较少，副产物少，剩余的纳米花生物催化剂可以过滤、洗涤重复使用，大大减少了成本。