[发明专利]一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用

说明书

本发明提供了一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将福尔马林固定标本依次浸泡于中性缓冲液和乙醇溶液中，随后进行真空干燥；(2)将步骤(1)干燥后的标本浸泡于中性缓冲液中并进行加热；(3)冷却至室温后，依次进行蛋白消化、DNA抽提、DNA沉淀和DNA洗涤，得到所述DNA。本发明的方法采用标本浸泡、适度加热和真空干燥三部进行标本预处理，有效置换出标本中的福尔马林，显著降低了DNA与蛋白质的交联作用，提取的DNA纯度高，完整性好，分子片段大于3kb，可作为模板扩增基因组序列。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用。

背景技术

福尔马林是常用的组织固定剂和防腐剂，具有渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快的优点，甲醛作为福尔马林固定液的主要成分，能够在较好地保持组织细胞完整性的同时快速杀死生物细胞并固定生物大分子。

福尔马林具有促进DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质、DNA与DNA交联的作用，但这一作用会造成标本中的DNA断裂、降解和脆性增加，同时阻碍蛋白酶的组织消化功能，影响组织DNA的提取。甲醛介导的DNA损伤在固定3h后便会发生，且固定时间越长，DNA损伤越严重。此外，甲醛与氧化物质接触后形成的甲酸，会改变环境的pH值，从而影响DNA分子的稳定性。

研究表明，采用经典的DNA提取方法从福尔马林长期保存的动物标本中提取基因组DNA，得到的DNA分子降解现象十分严重，仅可用于限制性内切酶消化实验和分子杂交实验，而且实验结果较差。PCR研究结果显示，福尔马林固定标本中的DNA通常会被降解成小于1kb的片段，无法作为模板进行PCR扩增。

虽然现有技术已经提出针对特殊材料的DNA的提取方法，但是这些方法从福尔马林样本中提取的DNA降解现象严重，无法作为模板构建物种基因组文库，不能满足现代分子生物学研究的需求。

CN101787364A公开了一种从陈旧福尔马林固定组织提取DNA的方法，所述方法利用微波热效应以水分子快速移除固定组织中的福尔马林，并消除福尔马林醛基引起的DNA-蛋白质交联，使DNA结构得以全部或部分恢复，从而获得较好质量的DNA。但是该方法以水分子替换组织中的福尔马林，会使标本大量吸水，容易造成细胞破裂。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法及应用，所述方法采用中性缓冲液和梯度乙醇溶液浸泡标本，并将标本置于真空管中干燥，促进了福尔马林的置换和挥发，同时对标本进行加热，降低了DNA与蛋白质的交联程度，提高了蛋白酶K的消化能力，提取的DNA片段完整性好，可作为模板进行PCR扩增。

第一方面，本发明提供了一种从福尔马林固定标本中提取DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将福尔马林固定标本依次浸泡于中性缓冲液和乙醇溶液中，随后进行真空干燥；

(2)将步骤(1)干燥后的标本浸泡于中性缓冲液中并进行加热；

(3)冷却至室温后，依次进行蛋白消化、DNA抽提、DNA沉淀和DNA洗涤，得到所述DNA。

本发明中，所述福尔马林具有甲基化修饰DNA的作用，通过甲基化作用使DNA与DNA之间、DNA与蛋白质之间形成交联，还可以诱导DNA内磷酸二酯键的断裂，形成嘌呤二聚体；同时，福尔马林对蛋白酶具有抑制作用，在提取过程中蛋白酶的消化能力显著降低。

本发明中，为了置换出标本中的福尔马林，在蛋白消化前，发明人采用中性缓冲液和乙醇溶液长时间地浸泡标本，并且将标本真空干燥以促进福尔马林的置换和挥发；同时，适度加热(95℃左右)标本，促使交联松解，提高了蛋白酶的消化效果。