[发明专利]对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体D及应用

说明书

本发明涉及一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体D及应用，该单克隆抗体D是由保藏号为：CCTCC NO:C2017151的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表位发生特异性结合。本发明研制的单克隆抗体D能够与PirA蛋白表位结合，所以使得单克隆抗体D能够应用到AHPND病原的早期快速检测中，为建立AHPND病原的单克隆抗体诊断方法，为研究AHPND的发病机理与感染动态、增殖特点、流行病学规律，继而实现切断感染途径、预防控制虾类AHPND奠定了坚实的基础。

技术领域

本发明属于分子免疫学和病原生物学交叉技术领域，是一种对虾肝胰腺病原 毒素蛋白PirA的单克隆抗体及应用，具体是抗对虾急性肝胰腺坏死病(AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)病原毒素蛋白PirA(Photorhabdus insectrelatedA，发光杆菌昆虫毒素关联基因A)的单抗及其制备与应用，

背景技术

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是近年来引起东南亚乃至全球养殖仔虾、幼虾 大量死亡的一种疾病。仅在我国，每年造成的直接经济损失超过10亿美元，严 重危害对虾产业的发展，已对全球的对虾养殖及相关产业造成了前所未有的打击 和影响。对于AHPND的病原，初始研究认为是携带有特定致病性质粒的副溶血 弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异菌株，进一步研究发现，该病可能与致病性 质粒所携带的PirA和Pir B毒素蛋白基因密切相关，台湾成功大学罗竹芳教授团 队通过一系列感染实验证实PirAB毒素基因就是诱导AHPND症状的毒素基因， 其中PirA约13kDa，Pir B约50kDa，且PirAB基因操纵子位于不稳定的序列 上，有可能在其他微生物间自由进出。后续研究表明PirA和PirB毒素蛋白的三 维结构与苏云金芽抱杆菌分泌的一种昆虫毒素蛋白非常相似，暗示苏云金芽抱杆 菌也可能引起对虾肝胰腺的坏死。黄海水产研究所黄倢博士团队发现坎氏弧菌 (V.Campbellii)也可导致对虾的AHPND，有证据显示，早先发现的副溶血弧 菌在自然条件下可将对虾急性肝胰腺坏死症致病基因PirAB传递给坎氏弧菌，使 其成为新的致病菌。

目前针对对虾AHPND，仍无有效的防制措施，如何早期诊断该病就迫在眉 睫。现有的分子生物学检测技术需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和 现场检测，免疫学检测技术可以形成简便快速的现场检测产品，应用免疫学检测 技术的关键在于制备高质量的抗体，近年来利用单克隆抗体技术，提高了免疫学 检测技术的权威性和特异性，使检测结果更加可靠。但至今尚无对虾AHPND毒 素蛋白单克隆抗体研制的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA 单抗及其制备与应用。本发明拟以毒素蛋白PirA基因所表达的多肽为抗原，应 用免疫学方法，制备出抗毒素蛋白PirA的单克隆抗体，为建立AHPND的早期 诊断技术及病原受体蛋白的研究提供新的思路。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体D，该单克隆抗体D是由 保藏号为：CCTCC NO:C2017151的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白PirA表 位发生特异性结合；

所述保藏号CCTCC NO:C2017151的杂交瘤细胞名称为杂交瘤细胞株 2N21-B，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学， 保藏日期2017年12月28日。

而且，所述CCTCC NO:C2017151的杂交瘤细胞是根据推测分析PirA蛋白 质氨基酸结构特性，人工设计合成PirA多肽-VLP蛋白载体复合物，然后将得到 的PirA多肽-VLP蛋白载体复合物免疫小鼠，将免疫小鼠脾细胞与SP2骨髓瘤细 胞融合产生的杂交瘤细胞。

而且，所述PirA多肽-VLP蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列为SQ12：TEVDSKHTPIIPEV。