[发明专利]核酸扩增

权利要求书

1.用于产生两个或更多个基本上单克隆的模板多核苷酸群的非诊断目的的方法，包括:

提供包含流体连通的两个或更多个反应位点的表面，其中两个或更多个反应位点的每一个包含多个固定的寡核苷酸引物和连接至固定的寡核苷酸引物的不同的单链或双链模板多核苷酸；

将两个或更多个反应位点与连续液相内的反应混合物接触，所述反应混合物包含在溶液中的寡核苷酸引物和聚合酶、重组酶，其中在溶液中的寡核苷酸引物与在两个或更多个反应位点处连接至固定的寡核苷酸引物的模板多核苷酸链的溶液引物结合位点互补；和

在等温核酸扩增条件下扩增连接至固定的寡核苷酸引物的模板多核苷酸，从而产生两个或更多个分离的在所述两个或更多个反应位点处连接至固定的寡核苷酸引物的基本上单克隆的模板多核苷酸群，其中所述反应混合物包括筛分剂和/或扩散减少剂，所述筛分剂和/或扩散减少剂限制或减缓多核苷酸通过反应混合物迁移；

其中两个或更多个反应位点在第一回合的核酸扩增中与第一反应混合物接触和在第二回合的核酸扩增中与第二反应混合物接触，其中所述第一回合的核酸扩增包括第一反应试剂载入回合，并且第二回合的核酸扩增包括第二反应试剂载入回合，其中第一轮反应试剂载入回合包括使反应位点与阻力化合物接触。

2.权利要求1的方法，其中在两个或更多个反应位点的每一个处的多个固定的引物连接至固体支持物。

3.权利要求2的方法，其中固体支持物是小珠或颗粒。

4.权利要求1-3的任一项的方法，其中聚合酶包含链置换活性并缺乏3’至5’外切核酸酶活性。

5.权利要求1-3的任一项的方法，其中筛分剂包含纤维素和/或纤维素衍生物。

6.权利要求1的方法，其中阻力化合物包含受体部分。

7.权利要求6的方法，其中溶液中的寡核苷酸引物包含与受体部分相互作用的亲和部分。

8.权利要求7的方法，其中亲和部分包含生物素并且受体部分包含抗生物素蛋白或抗生物素蛋白样部分。

9.权利要求7的方法，其中第二反应试剂载入回合不包括将反应位点与阻力化合物接触。

10.权利要求1-3的任一项的方法，其中两个或更多个反应位点可操作地偶联至传感器，所述传感器能够检测核苷酸并入副产物在位点内的存在。

11.权利要求10的方法，其中传感器包括场效应晶体管。

12.权利要求10的方法，其中传感器包括离子敏感性场效应晶体管。

13.权利要求1-3的任一项的方法，其还包括测序基本上单克隆的模板多核苷酸群。

14.权利要求13的方法，其中平行地测序基本上单克隆的模板多核苷酸群。