[发明专利]一种利用大肠杆菌合成3-香叶草基-4-羟基苯甲酸和厦门霉素的方法

说明书

本发明公开了一种利用大肠杆菌合成3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸和厦门霉素的方法，所采用的大肠杆菌菌株含有部分或全部经过密码子优化的厦门霉素合成相关基因及甲羟戊酸途径相关基因。该方法将厦门霉素合成所需的三个基因导入大肠杆菌；通过诱导表达这三个基因，在大肠杆菌中合成GBA和厦门霉素。进一步通过引入甲羟戊酸合成途径提高大肠杆菌胞内牻牛儿基焦磷酸的供给；并通过向发酵培养基中加入4‑羟基苯甲酸进一步提高GBA的产量。本发明合成3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸的产量达到94mg/L，合成厦门霉素的产量达到11mg/L。本发明首次实现了3‑香叶草基‑4‑羟基苯甲酸和厦门霉素在大肠杆菌中的生物合成。

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产3-香叶草基-4-羟基苯甲酸及其终产物厦门霉素的菌株。

背景技术

厦门霉素是厦门链霉菌产生的苯并吡喃类化合物。动物实验表明，其能够抑制纤维原细胞的收缩能力，并且能够很明显的减弱增生性瘢痕。目前，纤维化疾病以及心血管纤维化等已严重危害人类的健康。我们已证实厦门霉素是具有抗纤维化活性的新型小分子药物候选化合物。

厦门霉素在野生型厦门链霉菌中的产量约为10mg/L，且生产周期长。构建能高效合成厦门霉素的前体及终产物的基因工程菌具有潜在的应用价值。

3-香叶草基-4-羟基苯甲酸是一类重要的活性天然产物，是beta-secretase-1抑制剂，具有治疗阿尔兹海默症的潜力，近年来对该类化合物的化学合成和活性研究已成为热点。如现有文献名称为“Bioactive prenylated phenyl derivatives derived frommarine natural products:novel scaffolds for the design of BACE inhibitors”中公开了GBA及其衍生物的化学合成方法，通过初步的构效关系研究发现该类化合物是治疗阿尔兹海默症的活性先导化合物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，首次提供一种利用大肠杆菌生产厦门霉素的前体3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的菌株，并进一步异源合成厦门霉素。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种大肠杆菌菌株，所述菌株含有部分或全部经过密码子优化的厦门霉素合成相关基因及甲羟戊酸途径相关基因；所述的厦门霉素相关基因包括IDS2，ximB,ximD和ximE基因；所述的甲羟戊酸途径相关的基因包括mvaE,mvaS,ERG12，ERG8，MVD1和idI基因。

所述IDS2为将异戊二烯焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸缩合为牻牛儿基焦磷酸的基因；所述ximB为将4-羟基苯甲酸和牻牛儿基焦磷酸缩合为3-香叶草基-4-羟基苯甲酸的基因；所述ximD和ximE为将3-香叶草基-4-羟基苯甲酸转化为厦门霉素的基因；所述mvaE为将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因；所述mvaS为将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因；所述mvaE为将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因；所述ERG12为将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因；所述ERG8为将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因；所述MVD1为将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊二烯焦磷酸的基因；所述idI为将异戊二烯焦磷酸异构为二甲基丙烯基焦磷酸的基因。

所述的厦门霉素合成相关基因优选为来源于Streptomyces xiamenensis 318的ximB(AGY49248.1)，ximD(AGY49246.1)和ximE(AGY49249.1)，

以及IDS2优选为来源于以Picea abies的IDS2(ACA21458.2)基因为基础进行密码子优化并截短后得到，其序列如SEQ ID NO.5。