[发明专利]表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑cas系统针对表皮干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。其中构建并获得了两个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPR/Cas9针对GINS2的基因编辑效率。本发明提供的表皮干细胞GINS2敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对表皮干细胞进行GING2基因编辑，特别是涉及一种构建GING2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。

背景技术

表皮干细胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transit amplifying cellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。

人类多能干细胞(Humanpluripotent stem cells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspaced shortpalindromic repeats/CRISPR-associatedproteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。

GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一，位于人染色体16q24上，其mRNA长度为1196bp，编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶，在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明，GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用，如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达，也有文献表明，DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用，如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面，GINS均发挥了一定功能，特别是与染色体的分离密切相关。