[发明专利]一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。本发明以大米淀粉为底物，利用4‑α糖基转移酶和环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活性，采用普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4‑α糖基转移酶(TaAM)以及环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)进行多酶偶联提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。

技术领域

本发明涉及一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是通过α,α-1,1-糖苷键连接而成的安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，对生物大分子有着非特异性的保护作用，是一种甜味剂，能更好的改善食品风味，因此被广泛应用于食品、医学、农业、化妆品等行业。

自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖对生理功能作用的研究，现已成为国际上开发研究的主要低聚糖之一。

海藻糖的合成主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中双酶法生产海藻糖转化率高达80％以上，其作用机理为以淀粉为底物经普鲁兰酶脱支为麦芽糊精、麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α-1,4-糖苷建，通过分子内转糖苷作用将α,α-1,4-糖苷键转为α,α-1,1-糖苷键，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，具有低成本的优点，但是双酶法麦芽寡糖基海藻糖合成酶对麦芽四糖和麦芽三糖的亲和性较低，导致反应液中的小分子麦芽糖难以利用，使得在工业生产中淀粉底物的利用率降低，从而提高了生产成本。

鉴于此，开发一种能将反应液中小分子麦芽糖进行糖苷化连接的多酶偶联方法对提高海藻糖产量具有十分重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明以大米淀粉为底物，利用4-α糖基转移酶和环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活性，采用普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4-α糖基转移酶(TaAM)以及环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)进行多酶偶联提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种多酶偶联生产海藻糖的方法，所述方法为以淀粉为底物，经α-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4-α糖基转移酶(TaAM)、环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和糖化酶共同作用合成海藻糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液煮沸，加入α-淀粉酶搅拌，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液降温至一定的温度后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶进行酶催化反应，然后灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到合适pH，加入糖化酶糖化。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入α-淀粉酶搅拌25～30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至55～65℃后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶，调节pH至5～6，在120～180r/min的转速下于60℃的水浴摇床中进行酶催化反应30～35h，然后沸水浴灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到pH为4～5，加入糖化酶于55～65℃糖化18～24h。