[发明专利]通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法

权利要求书

1.通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以常规方法采集人类粪便样品；

(2)利用RNA提取试剂盒提取粪便样品的总RNA；

(3)按照常规小RNA建库流程和方法，构建小RNA文库；

(4)利用高通量测序技术平台对粪便样品中的小RNA进行高通量测序；

(5)对测序结果进行小RNA数据的生物信息学分析，以确定人体内植物来源的miRNA及其丰度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所用RNA提取试剂盒是下述的任意一种：BIOG RNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒、Stool RNA Kit(200)粪便RNA提取试剂盒、强力粪便RNA提取试剂盒PowerMicrobiome RNA Isolation Kit。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所用RNA提取试剂盒是BIOGRNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒，由吸附柱、收集管、裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、析出液、洗涤液、洗脱液和消化液组成，另自行准备好无水乙醇、PBS和1.6mL离心管；步骤(2)的具体操作步骤如下：

(1)取出试剂盒中的析出液和洗涤液，按以下操作：

a)析出液：4.5mL加入25.5mL无水乙醇；9mL加入51mL无水乙醇；

b)洗涤液：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇；

c)配制好的析出液如出现沉淀，将其在37℃溶解，摇匀后使用；

(2)取200mg的粪便于试管中，若粪便样本为液态则取200μL于试管中；加入2mL PBS充分振荡混匀，300g离心5分钟，收集上清；取收集的上清液1mL于1.5mL离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清后沉淀用1mL PBS重悬，振荡混匀后，12000rpm离心5分钟，收集沉淀；

(3)加入200μL裂解液Ⅰ，悬浮沉淀，37℃放置30分钟；

(4)加入200μL裂解液Ⅱ，20μL消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10分钟；

(5)加入600μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验；

(6)将吸附柱放入收集管内，取步骤(5)所得溶液600μL转入吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；

(7)将剩余400μL步骤(5)所得溶液转入上述吸附柱内，重复操作步骤(6)；

(8)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；

(9)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；

(10)取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入30-100μL洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集RNA溶液；提取的RNA-70℃保存，或直接用于下一步实验。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：

(1)先用1wt.％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计检测RNA质量，用Alignent2100RNA 6000Nano Kit检测RNA整齐度；

(2)用含15wt.％聚丙烯酰胺的变性凝胶分离小分子RNA，再用小片段RNA回收试剂盒回收并纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头进行反转录合成；其中，5’为5’-RACE-Ready cDNA，3’为3’-RACE-Ready cDNA；

(3)进行PCR扩增，并且构建小分子RNA的cDNA文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：

(a)数据质量控制

利用生物信息学软件对小RNA测序得到的原始序列进行数据质量统计，然后根据统计结果，用过滤软件过滤原始序列中测序质量值低于20的序列，及建库过程中使用的3’和5’端的接头序列；

(b)植物来源miRNA及其丰度鉴定

从公共数据库或已发表文章中下载已知植物所有小RNA成熟序列和前体序列，利用比对软件将过滤后的读序比对至已知植物miRNA成熟序列，结合miRNA鉴定软件鉴定粪便样品中植物性miRNA的种类及丰度。