[发明专利]一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法

说明书

本发明公开了一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法。本发明通过对青篱柴进行转录组测序及序列分析，开发了大量的分子标记，从中筛选出了8对多态性引物，其步骤如下：（1）转录组测序；（2）SSR特性分析（3）筛选SSR位点；（4）SSR引物设计；（5）DNA提取；（6）SSR引物合成；（7）SSR引物筛选；（8）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性引物。本发明通过对20个来自不同地理位置的青篱柴样品进行DNA扩增及检测，发现上述8对多态性引物，其多态性丰富，重复性好，可应用于青篱柴遗传资源评价、引种栽培、种质资源多样性评价、亲缘关系鉴定，遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种。

技术领域

本发明属于生物学分子标记分子遗传技术领域，具体涉及一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法。

背景技术

青篱柴(Tirpitzia sinensis)是亚麻科(Linaceae)青篱柴属(Tirpitzia的一种灌木或小乔木，主要集中分布于我国贵州、广西和云南等西南喀斯特地区。青篱柴的茎和叶能活血、止血、消肿止痛和接骨，在民间有较高的药用价值，而花具有很好的生态观赏价值，可以引种栽培于园林庭院美化环境。尽管青篱柴具有重要的生态和经济效益，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，尤其SSR分子标记的研究还未见报道。

简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，随机、广泛、均匀地分布于真核生物基因组中，由于重复次数不同而造成简单序列长度多态性(SSLP)。不同物种的简单重复序列差异很大，主要表现在重复次数、基序类型、长度以及在染色体上的分布情况等，从而反映出物种间高度的等位基因多样性。虽然SSR序列具有高度多态性，但其两端的序列一般都比较保守和专一，因此可凭借两端的保守序列设计特异性的SSR引物，通过PCR技术扩增出SSR序列，再利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术获得其长度多态性。由于多态性高、技术重复性好，易于操作等优点，目前，SSR分子标记一直被广泛应用于物种的遗传分析，已经在物种的纯度鉴定、基因功能定位、分子辅助育种、遗传图谱构建以及亲缘关系分析等方面有广泛的应用。

目前，青篱柴尚无基因组信息及SSR引物。因此，针对青篱柴在SSR分子标记方面的研究空白，如何基于转录组测序获取青篱柴SSR引物，从而更好的揭示青篱柴资源的亲缘关系，探究其在不同地理分布区的遗传差异，揭示其物种分化过程，获取其优质物种资源成为了该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法，从而更好地研究不同地理分布区青篱柴的遗传差异及亲缘关系，用于获取青篱柴优秀种质资源。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法，包括以下步骤：

(1)取贵州省黔东南苗族侗族自治州的青篱柴作为样品，将同一株青篱柴根、茎、叶3种组织做转录组测序；

(2)分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，利用MISA软件对青篱柴转录组测序后组装出的Unigene序列进行SSR位点检测和分析，筛选SSR位点，搜索设置为单核苷酸重复至少10次，二核苷酸重复至少6次，三至六核苷酸重复至少5次；

(3)采用Primer 3.0引物批量设计程序对SSR位点的两端序列进行引物设计；

(4)利用植物基因组DNA提取试剂盒提取来自黔南布依族苗族自治州不同地理位置的20份青篱柴样品的DNA；

(5)根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0对(3)中已设计好的引物进行进一步筛选，最终选取50对引物序列送至公司进行合成，引物合成后进行PCR扩增；

(6)采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性引物，根据电泳检测显影结果，分析其多态性。