[发明专利]一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法

说明书

一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，本发明涉及一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法，本发明的目的是为了提高血小板裂解液中CD41+、CD81+的微囊，本发明通过冲击波分级冲击，增加形成和释放了血小板中的细胞因子和CD41+、CD81+的微囊。本发明的血小板裂解液中含有的微囊浓度为120μg/mL，微囊总蛋白为7‑9μg/mL，有69.33±2.33％微囊粒径集中在30‑150nm范围，15.10±3.20％微囊粒径集中在150‑300nm范围，可以释放大量的血小板细胞因子，本发明应用于生物技术领域。

技术领域

本发明涉及一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法。

背景技术

血小板在很长时间内被看作是血液中的无功能的细胞碎片，直到1882年意大利医师Bizzozero发现它们在血管损伤后的止血过程中起着重要作用，才首次提出血小板的命名也从此开启了探究血小板凝血、止血、维护毛细血管壁完整性历程。现在人们已经认识到，血小板具有重要的功能。

血小板从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，体积小，直径为2-3微米，无细胞核。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10～30万)。血小板在生理状态的血小板成静息状态，其胞内溶酶体、致密颗粒和α颗粒含有大量凝血因子、细胞因子、趋化因子、粘附因子、免疫蛋白、呈现一种平衡状态。当血管受损害或破裂时，血小板受刺激，由静止相变为机能相，迅即发生变形，表面粘度增大，凝聚成团；同时在表面第Ⅲ因子的作用下，使血浆内的凝血酶原变为凝血酶，从而实现病理状态的血小板激活。大量的细胞因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子β(TGF-β)，类胰岛素生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)等150多种因子和胞外微囊，在激活的过程中从血小板α颗粒中释放出来，起到刺激细胞扩增、伤口愈合、炎症反应、血栓形成、免疫调节等作用。近20年来血小板的作用已被应用于多学科临床实践，包括颌面外科，骨科，心胸外科、神经外科，妇产科、眼科、普外整形美容科等等。

血小板内的细胞因子、胞外微囊可以通过采用胶原，凝血酶，氯化钙，机械损伤，体外裂解等多种形式从血小板中释放出来，而且释放效率和数量因方法不同而结果不同，在未来的应用效果也不尽相同，由于胞外微囊由于其载药能力、富含生长因子在临床应用前景越来越受到科学界的重视。血小板分泌的胞外微囊(EV)直径在30-500nm范围，其中30-140nm大小的也称为外泌体(exosomes)，体积150nm以上的也被成为血小板微粒(MPs)，由于其富含细胞因子和有效物质细胞内外传递作用，因此二者均有组织再生修复功能，并且组织修复能力的大小和微囊含量正相关。目前常用在临床的方法为采用凝血酶和钙离子进行激活，而这种方法对血小板分泌物，特别是有再生修复能力的CD41+、CD81+微囊释放浓度低于10μg/mL，血小板裂解液中微囊的含量少，从而并未实现血小板的再生修复功能的最佳状态。

发明内容

本发明的目的是为了提高血小板裂解液中CD41+、CD81+微囊的含量，提供了一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法。

本发明一种富含CD41+、CD81+微囊的血小板裂解液制备方法按以下步骤进行：一、用聚焦式体外冲击波仪以频率15Hz，能流密度0.15～0.20mJ/mm²，室温下冲击富含血小板血浆或富含血小板生理盐水200-500次后，37度孵育10-15分钟；

二、再以频率15Hz，能流密度0.20～0.25mJ/mm²，室温下冲击700-1000次，37度孵育20-30分钟；

三、然后以频率15Hz，能流密度0.25～0.30mJ/mm²，室温下冲击1500-2000次，37度孵育10分钟，得到悬液；