[发明专利]白花檵木在制备脐带间充质干细胞培养上清中的应用

权利要求书

1.白花檵木提取物用于脐带间充质干细胞培养上清收集。

2.一种脐带间充质干细胞培养上清收集方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；

(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；

(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤

(4)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(5)接种

将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(6)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO₂培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基即DMEM培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO₂浓度为5.0±0.2％；

(7)换液

第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO₂培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；

第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；

(8)收获原代细胞

细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；

去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入4ml含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到50ml离心管中离心；

(9)原代细胞传代即P0传P1

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO₂培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO₂浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；

(10)干细胞培养上清

根据步骤(8)-(9)，细胞传代至第四代P4；

除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水缓冲液，加入质量百分比浓度0.5-5％白花檵木提取物的DMEM培养基，饥饿培养48小时；

吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子。

3.按照权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞培养上清收集方法，其特征在于，脐带华通氏胶的剥离并洗涤：在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤。