[发明专利]一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法

说明书

本发明涉及一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，属于水产养殖领域中水产动物种质鉴定技术领域。其首先收集收集鲢鳙鳍条样本，并采用传统酚‑氯仿的方法提取基因组DNA，随后根据目的扩增片段长度差异的要求涉及引物对，选取扩增条带清晰的3组4重PCR体系，共涉及12个微卫星标记，最后对引物进行荧光修饰及扩增验证。本发明所述多重PCR方法，具有操作快捷、实施简便、费用低廉等特点，可为鲢鳙种质遗传评估和家系选育等研究提供一种新的分子标记辅助技术。

技术领域

本发明涉及一种鲢鳙通用微卫星荧光多重PCR的方法，适用于鲢鳙群体遗传变异和亲子鉴定等研究，属于水产养殖领域中水产动物种质鉴定技术领域。

背景技术

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Hypophthalmichthys nobilis)为鲤科鱼类中的近缘物种，作为中国重要土著鱼类，广泛分布于各大江河湖泊中。两者均属虑食性鱼类，是净水渔业的重要生物资源，在目前水环境保护和治理中具有重要生态价值。同时，两者作为中国传统大宗淡水鱼养殖品种，具有悠久的养殖历史，养殖体量大，在中国淡水渔业中占有极其重要的经济地位。因此，对鲢鳙种质资源的有效保护和利用具有重要意义。然而，受水利设施建设、环境污染、过度捕捞等影响，鲢和鳙的野生资源受到严重冲击，近年来野生资源量呈急剧下降趋势。此外，由于成鱼个体大、繁殖周期长等特点，两种鱼的选育实施难度较大，在其养殖业中良种覆盖率较低，亲本来源对野生资源的依赖程度较大。目前，鳙尚未获得选育良种，且养殖群体正面临生长减慢、抗病力下降和遗传多样性降低等种质退化的风险。因此，开展对鲢鳙的群体种质评估，并基于群体资源开展品种改良和选育工作，有助于减少对野生资源的依赖，并为其渔业养殖的可持续发展提供保障。

中国鱼类遗传育种工作开展较多，并有很多成功案例，对中国水产养殖业健康可持续发展起到重要支撑作用。其中，群体选育是开展水产动物育种最简单的方法，主要基于目标性状和表型进行逐代选择，相对省时省力，在许多环境下可获得较快遗传进展，被广泛应用于鱼类育种；且在群体选育中，通常涉及一些种群间(或群体)间的交配组合涉及。鲢和鳙在中国广泛分布，具有较多的地域种群(或群体)，可为开展其遗传改良研究提供物质基础。此外，家系选育也是鱼类遗传改良中常用的育种技术，通过建立大量家系，掌握繁殖后代的家系数和系谱关系，有利于逐代选择中的交配方案制定，可有效降低近交概率并提高选择压力。然而，鲢鳙的亲本个体大、保种成本高、构建大量家系比较困难，加之鲢鳙的产卵量大，繁殖行为基础数据匮乏，目前尚未见报道有群体或家系选育相关工作的开展。

针对以上提及的实际问题，本发明设想借助微卫星分子标记(microsatellite)开展鲢鳙的群体遗传研究和亲子鉴定等研究。一方面，可以了解目前鲢鳙的种质资源遗传现状，为开展选育工作提供背景数据；另一方面，通过构建亲子鉴定技术，为开展家系选育提供技术支持。在过去的几十年里，对中国鲢鳙群体的野生资源的遗传多样性研究也有较多开展，如基于形态学、同工酶和分子标记等方面的遗传比较，可为开展群体选育提供基础参考；其中也有采用微卫星标记开展的群体遗传研究，但检测技术多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在分辨率和准确性上存在提高和改进的空间。而微卫星标记作为动物系谱鉴定常用的分子标记，在鲢鳙的亲子鉴定研究中尚未见报道；因此，筛选适合的微卫星标记并用于构建鲢鳙亲子鉴定技术具有重要的现实意义。

近年来，随着分子检测技术的不断发展，对微卫星标记等位基因的分型技术也越来越精确和高效，已由传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法，逐步发展到毛细管电泳检测技术；其中，结合应用荧光基团(FAM和HEX等)修饰引物和高密度DNA内参标记(GS500和ROX500等)开展的测序仪毛细管电泳检测技术越来越多被用于微卫星标记的分型中，具有分辨率高、准确率高、重复性好和便于高通量检测等优点。此外，随着生物试剂稳定性的不断提高，多重PCR技术的摸索和构建也越来越便利，该方法也逐渐被应用于微卫星标记的扩增中，能有效提高实验效率并降低实验成本。