[发明专利]特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属Vkorc1基因编码区的引物组和方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属Vkorc1基因编码区的引物组和方法。所述引物组包括3对用于分别扩增Vkorc1基因3个外显子的引物，扩增第1外显子的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，扩增第2外显子的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，扩增第3外显子的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示。本发明通过优化了扩增条件提供了基于该引物组的扩增方法。为田鼠属和毛足田鼠属鼠类的Vkorc1基因扩增，及其与抗药性之前的相关研究提供了良好的基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及特异性扩增田鼠属和毛足田鼠属Vkorc1基因编码区的引物组和方法。

背景技术

抗凝血类灭鼠剂是目前防控鼠类的主要化学灭鼠剂，它们可以与维生素K循环中的VKOR酶相结合，阻止还原型维生素K的生成，从而进一步阻止凝血因子的活化，导致凝血功能障碍。研究表明抗凝血类灭鼠剂8-10年之后就出现了抗性鼠，抗药性的产生极大降低了灭鼠剂的使用效率。因此，在实际鼠害防控过程中应及时检测鼠类种群的抗性水平，根据抗性水平选择合适的抗凝血类灭鼠剂，即在抗性水平较低的地区优先使用低毒的第一代灭鼠剂，在出现抗性的地区要使用毒性更强的第二代抗凝血类灭鼠剂，防止抗性种群的继续扩散。

田鼠类是危害我国农田和草原的主要害鼠种类之一，常见的田鼠种类包括仓鼠科田鼠属的东方田鼠(Microtus fortis)、莫氏田鼠(Microtus maximowiczii)，以及毛足田鼠属的布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)、棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)等，这些田鼠会对农田和草原造成巨大损失，主要危害作物约有16科近40种，危害严重时可造成小麦减产15％以上，苹果损失10～15％。

Vkorc1基因是抗凝血类灭鼠剂的靶基因，该基因上的变异是鼠类对抗凝血类灭鼠剂产生抗药性的重要机制之一。目前，在NCBI、Uniprot以及各种文献上公开了褐家鼠、小家鼠等33种鼠的Vkorc1基因，褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠等鼠种已经有发表的引物，然而，这些引物并不能用来扩增布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)、棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)、莫氏田鼠(Microtus maximowiczii)、东方田鼠(Microtusfortis)等鼠类的Vkorc1。NCBI中田鼠类仅有橙腹草原田鼠(Microtus ochrogaster)的基因组参考序列，包含Vkorc1基因的注释，但用于扩增橙腹草原田鼠的Vkorc1引物未见报道。仓鼠科田鼠属至少包含65种不同的物种，Barbosa等(2018)认为田鼠属至少分为两个主要的支系，一支以橙腹草原田鼠(M.ochrogaster)为代表的向北美辐射进化产生的田鼠类，另一支以根田鼠(M.oeconomus)为代表的从亚洲向欧洲以及北美辐射进化产生的田鼠类，因此橙腹草原田鼠与亚洲的田鼠类已经产生较大的遗传分化。Galewski等(2006)通过建立田鼠亚科不同鼠类的线粒体细胞色素b的系统发育树，发现毛足田鼠属的棕色田鼠与橙腹草原田鼠的亲缘关系较远。

发明人通过实验发现，根据橙腹草原田鼠的Vkorc1序列设计的引物并不能完全的扩增出我国田鼠属和毛足田鼠属的鼠类Vkorc1序列全长。目前，对于我国常见的田鼠属和毛足田鼠属的鼠类的Vkorc1序列及扩增的引物还未见报道，对于田鼠属的莫氏田鼠(Microtus maximowiczii)、东方田鼠(Microtus fortis)和毛足田鼠属的布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)和棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)等可产生严重危害的田鼠类的Vkorc1基因尚属未知，且目前尚未见到针对上述田鼠的抗凝血类灭鼠剂产生抗药性的研究报道。

因此，亟待开发对仓鼠科田鼠属和毛足田鼠属的Vkorc1基因进行特异性扩增的引物和方法，进而为其抗药性研究提供基础。

发明内容