[发明专利]一种高效全降解聚己内酯的方法

权利要求书

1.一种高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于，在聚己内酯降解中使用双功能融合酶进行降解，所述的双功能融合酶为含脂肪酶和角质酶活性的双功能融合酶Lip-Cut，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：在磷酸盐缓冲液中，加入聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut，在最适温度下水解8h以上，即可实现聚己内酯的全降解。

3.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液为pH=8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的聚己内酯和双功能融合酶Lip-Cut的重量比为400-500：1。

5.根据权利要求2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的最适温度为40℃。

6.根据权利要求1或2所述的高效全降解聚己内酯的方法，其特征在于：所述的双功能融合酶 Lip-Cut 的编码基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。

7.双功能融合酶 Lip-Cut在聚己内酯降解中的应用；所述的双功能融合酶 Lip-Cut由以下方法制备获得：将脂肪酶的基因片段和角质酶的基因片段通过来自草菇 EG1 的天然linker 连接，获得融合基因，构建脂肪酶和角质酶的融合基因的表达载体，并在 Pichia pastoris 中表达，获得双功能融合酶；包括以下步骤：

1）以Lip基因序列为模板，采用引物 5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCcggcctgttcgacgagcggt-3’ 和引物 5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’ 进行PCR 扩增获得融合酶 Lip-Cut 的 Lip 片段；以 Cut 基因序列为模板，采用引物 5’-acccaaccccacctccagtggctgcccgaatgccaccaagGCCCCAACACAGCCA-3’ 和引物 5’-gagatgagtttttgttctagaAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’ 进行 PCR 扩增获得融合酶Lip-Cut 的含 linker 的 Cut 片段；

2）以双功能融合酶 Lip-Cut 的 Lip 片段和 Cut 片段为模板，采用引物 5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCcggcctgttcgacgagcggt-3’和引物 5’-gagatgagtttttgttctagaAATCAATGATGATGATGATGATGAGCATCACCAATCTT-3’ 进行 PCR 扩增获得融合基因 Lip-Cut，其中 5'端的 Lip 通过来自 EG1 的天然连接序列与 3' 端的 Cut 连接；将融合基因 Lip-Cut 克隆到载体 pPICZaA 中，转入巴斯德毕赤酵母 KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶 Lip-Cut。