[发明专利]真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白

权利要求书

1.一种真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体高表达GDF11基因，所述真核表达载体具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的真核表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

提供pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重组质粒，将GDF11基因片段插入到所述pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重组质粒的多克隆位点，得到所述真核表达载体；

将以DHFR片段和KKS片段为模板，KKSDR和DHFR-R为引物扩增得到的KSH-DHFR片段与pcDNA3.1⁺质粒连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到所述pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重组质粒；

其中，所述KKS具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述KKSDR具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述DHFR-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以人脂肪干细胞的cDNA为模板，DHFR-F、DHFR-R为引物，扩增得到所述DHFR片段；

其中，所述DHFR-F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以GDF11基因序列NCBI ReferenceSequence：NM_005811为模板，GDF11-F和GDF11-R为引物，扩增得到所述GDF11基因片段；

其中，所述GDF11-F具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

所述GDF11-R具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述GDF11基因片段插入到所述pcDNA3.1⁺-KSH-DHFR重组质粒的多克隆位点，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到所述真核表达载体。

6.一种稳定高效表达重组蛋白GDF11的真核表达系统，其特征在于，宿主细胞为哺乳动物细胞CHO；

所述真核表达系统的制备方法包括如下步骤：将权利要求1所述的真核表达载体或采用权利要求2-5任一项所述的制备方法制备得到的真核表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，至细胞活率达到95%以上，得到所述真核表达系统。

7.根据权利要求6所述的真核表达系统，其特征在于，使用CD OptiCHOTM培养基进行筛选。

8.由权利要求6所述的真核表达系统表达的GDF11蛋白；

所述GDF11蛋白上设有His标签。

9.如权利要求8所述的GDF11蛋白的纯化方法，其特征在于，将转染有所述真核表达载体的CHO细胞培养基过镍柱进行纯化，得到纯化后的GDF11蛋白。

10.根据权利要求9所述的GDF11蛋白的纯化方法，其特征在于，将转染有所述真核表达载体的CHO细胞培养基过镍柱后，先用含有50 mM咪唑的PBS洗脱至基线平衡，再用含有300mM咪唑的PBS洗脱，在30 kd处有明显条带，为纯化出的GDF11蛋白。