[发明专利]一种提高米尔贝链霉菌抗生素产量的方法

说明书

本发明公开了一种生物医药技术领域的提高米尔贝链霉菌抗生素产量的方法，通过构建aveR基因的对应整合表达质粒pIB139‑R，并将所述的整合表达质粒转入米尔贝链霉菌中，实现米尔贝霉素A3和A4产量的提高。

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法及其质粒，具体是一种提高米尔贝链 霉菌抗生素产量的方法及其质粒。

背景技术

随着生物工程技术在微生物尤其是抗生素育种领域的应用，基因工程育种技术已成 为主要的菌种改良手段，并且在改良工业生产菌种方面已获得巨大的成功。生物工程育种技 术在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲目性，可以借助对微生物次级代谢生物合 成途径的认识，利用基因工程技术构建抗生素高产菌株，有助于次级代谢产物的工业生产。 由于链霉菌的商业价值，提高链霉抗生素产量的方法显得十分重要，这些方法包括两类。一 类是通过理化方法对链霉菌进行诱变，在突变株中筛选高产菌株。另一类是通过遗传学方法， 对菌株进行遗传改变，提高抗生素的产量。通过理化方法对链霉菌进行诱变已经取得了很大 的成绩，得到了大量的高产菌株。但是，这种方法的筛选工作量大，而且具有一定盲目性。 随着对细菌基因组研究的深入，用遗传学的方法育种能降低操作的盲目性，而且使工作量大 大降低。

米尔贝霉素是一种十六元大环内酯化合物，是由米尔贝链霉菌发酵产生的，其能用 于控制和预防螨虫和各种园农害虫。由于其药性高、使用安全、毒性极低、易被降解、对环 境无害等特征，米尔贝霉素A3和A4的衍生物已经投入商业使用。

aveR是阿维链霉菌中的一个途径特异性正调控基因，可以正调控阿维菌素的生物合 成。而aveR编码的蛋白质与米尔贝链霉菌中的milR基因编码的蛋白质均属于LuxR家族(LAL家族)，而milR基因对米尔贝霉素的生物合成具有正调控作用。由于AveR和MilR 具有高同源性，因此推测可能aveR基因对米尔贝霉素的生物合成具有正调控作用。

发明内容

本发明涉及一种提高米尔贝链霉菌抗生素产量的方法，通过构建aveR基因的对应整 合表达质粒pIB139，并将所述的整合表达质粒转入米尔贝链霉菌中，实现米尔贝霉素A3和 A4产量的提高。

本发明所述的aveR基因，是指阿维菌素生物合成的途径特异性正调控基因，如SeqID No.1所示。

本发明提供的提高米尔贝链霉菌抗生素产量方法：第一步，从阿维链霉菌A198中扩 增得到包含途径特异性调控基因aveR的片段，将该片段克隆到含红霉素抗性基因强启动子PermE*的载体pIB139上，得到含有aveR基因片段的重组质粒。在本发明的实施例中构建 了一个重组质粒pIB139-R。第二步，通过链霉菌接合转移的方法将pIB139-R导入抗生素产 生菌突变株S.milbemycinicus 27中。通过抗生素筛选得到包含aveR基因片段的重组菌株突 变株S.milbemycinicus J37。第三步，针对重组菌株进行抗生素测定，得到抗生素高产菌株。 本发明的实施例在米尔贝链霉菌中实现了抗生素上调。对该方法的具体说明请参考本发明的 实施例。

本发明涉及的米尔贝霉素A3和A4的高产菌株，其产量是野生型菌株该组分产量的2.4倍和1.6倍，而米尔贝霉素A3和A4是米尔贝霉素系列中最具商业价值的成份。通过该 工程菌可以大规模生产系有效组份，所以具有显著的工业应用价值。

附图说明

图1为重组质粒pIB139-R的构建图

图2为重组质粒pIB139-R的酶切验证

M1：Supercoiled DNA Marker；1：未酶切的重组质粒pIB139-R；2：酶切过后的重组质粒pIB139-R；M2：1 kb DNA Ladder

图3为重组质粒pIB139-R的PCR验证