[发明专利]一种特发性基底节钙化致病基因突变小鼠模型的构建

权利要求书

1.一种突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，于2017年11月9日保藏在位于武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C2017256。

2.一种特发性基底节钙化疾病小鼠模型，其Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基由CC突变为GG。

3.权利要求2所述的特发性基底节钙化疾病小鼠模型在筛选用于治疗特发性基底节钙化疾病药物中的应用。

4.一种特发性基底节钙化疾病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)将小鼠Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基CC突变为GG，从而使第602位密码子TCC突变为TGG，得到Slc20a2 Knock-in小鼠打靶载体；

(2)将打靶载体线性化后转染ES细胞，药物筛选出阳性ES克隆，通过显微注射构造阳性ES克隆囊胚，得到嵌合雄鼠，将嵌合率大于50％的成熟雄鼠与雌鼠交配，获得双臂阳性F1代小鼠，将F1代小鼠进行自交，分别获得野生型Slc20a2 Knock-In小鼠、杂合型Slc20a2Knock-In小鼠及纯和型Slc20a2 Knock-In小鼠；

(3)取上述步骤(2)获得的雄性可育成年杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠，进行精子的提取，得到突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，将提取的精子浸入液氮中保存；

(4)取步骤(3)中保存在液氮中的突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]进行复苏，检测精子活力正常后，取成年野生型小鼠卵子进行体外受精，再进行胚胎移植，繁殖小鼠获得杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠后代，通过此基因型的雌雄后代小鼠交配获得25％的野生型(WT)Slc20a2 Knock-In小鼠、50％的杂合型Slc20a2Knock-In小鼠及25％的纯和型Slc20a2 Knock-In小鼠，对所获得的小鼠进行基因型鉴定，鉴定为纯和型Slc20a2Knock-In的小鼠即为特发性基底节钙化疾病小鼠模型。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的将打靶载体线性化后转染ES细胞的方法是：将打靶载体线性化后通过电转染的方法转染ES细胞。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的雌鼠为C57BL/6J雌鼠。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的进行精子的提取和将提取的精子浸入液氮中保存具体方法是：将精子冷冻液解冻后加浓度为1uL/1mL的硫代甘油混均，提取所述的雄性可育成年杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠的附睾于加有硫代甘油的冷冻液中，在显微镜下将附睾剪破使精液流出，室温放置8-12分钟，优选10分钟，将小鼠精液与加有硫代甘油的冷冻液混均后装入冻存管中，在液氮上空预冷后浸入液氮中保存。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的检测精子活力的具体方法是：室温条件下从液氮中取出存有所述含精子的冻存管，室温放置15-30秒，优选20秒，37℃水浴25-35秒，优选30秒，从冻存管中取10-20uL含精子的混合液至HTF平衡液中，转移至培养箱中放置15-60min，显微镜下观察精子活力。

9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的对所获得的小鼠进行基因型鉴定的具体方法是：剪取小鼠脚趾提取基因组DNA进行Sanger法测序。

10.权利要求4至9中任一项所述的构建方法获得的特发性基底节钙化疾病小鼠模型在筛选用于治疗特发性基底节钙化疾病药物中的应用。