[发明专利]一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法

说明书

一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法,属于细胞工程技术领域。针对细胞融合效率低的问题，本发明提供了一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法，是以小鼠胚胎干细胞(mESC)作为细胞融合对象，用含质量分数0.25％胰酶的消化液将mESC消化成单细胞，利用细胞凝集素构建一对一的单细胞对，在含有50％聚乙二醇中培养1min，随后将细胞继续培养7天，获得小鼠胚胎干细胞融合细胞。本发明适用于动物育种的研究或单克隆抗体的生产。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法。

背景技术

细胞融合主要用于制备诊断试剂，治疗疾病和运载药物的单克隆抗体，近年来细胞融合也被应用于基础研究，例如周琪团队利用细胞融合技术产生具有胚胎干细胞特性的异种二倍体杂合干细胞，为进化生物学、发育生物学和遗传学等研究提供新的模型和工具。细胞融合对于基础研究至关重要，也具备重要的应用价值。细胞融合过程分为4个阶段：细胞间接触、细胞质膜融合、细胞质重组和遗传物质的选择。迄今为止细胞融合方法主要有三种，仙台病毒、电融合和聚乙二醇(PEG)。但是目前主要利用聚乙二醇介导细胞融合，Cowan利用5×10⁷个人的胚胎干细胞与5×10⁷个体细胞融合，融合效率仅为0.000004％，得到2个克隆。Yu通过1.3×10⁷个人的干细胞和4.7×10⁷个骨髓前体细胞融合，效率也只有0.00067％，2010年Hasegawa将融合效率提高到0.005％通过融合人成纤维细胞和人ES，Sumer在进行融合研究时，融合效率有了质的提升，将0.5×10⁶个小鼠ES细胞与1×10⁶个小鼠胎儿成纤维细胞融合效率达0.77％，而0.5×10⁶个小鼠诱导干细胞(mips)和1x10⁶个小鼠胎儿成纤维细胞融合效率为1.74％。上述细胞融合方法中细胞融合的效率均较低。

发明内容

针对目前细胞融合效率低的问题，本发明提供了一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法，将小鼠胚胎干细胞经胰酶消化成单细胞后，利用细胞凝集素构建一对一的单细胞对，所述单细胞对在聚乙二醇的作用下进行融合培养后获得融合细胞。

所述融合方法具体包括如下步骤：

1)细胞培养：选择小鼠胚胎干细胞在ES培养液中进行培养,获得小鼠胚胎干细胞细胞克隆；

2)单细胞融合：将小鼠胚胎干细胞细胞克隆经胰酶消化后获得单细胞，无血清的ES培养液与细胞凝集素制备成小滴，所述小滴中细胞凝集素的终浓度为100μg/ml；所述单细胞在每个小滴中贴合构建成一对一的单细胞对，然后在聚乙二醇的作用下经融合培养获得融合细胞。

优选地，步骤1)所述的小鼠胚胎干细胞的培养是在饱和湿度、37℃、体积分数5％的CO₂、体积分数21％的O₂的条件下进行的，每天更换ES培养液，每2天用胰酶质量分数为0.25％的胰酶消化液消化处理后传代一次。

优选地，步骤1)所述ES培养液的基础培养基为DMEM，所述ES培养液中还含有质量分数15％的胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1000U/mL白细胞抑制因子、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％双抗，所述各添加的成分浓度为其在ES培养液中的终浓度，所述双抗是指同时含有青霉素和链霉素两种抗生素的试剂。

优选地，步骤2)所述无血清的ES培养液的基础培养基为DMEM，所述无血清的ES培养液中还含有2mM谷氨酰胺、0.1mMβ巯基乙醇、1000U/mL白细胞抑制因子、质量分数1％非必需氨基酸、质量分数1％双抗、3μM CHIR99021和1μM PD0325901，所述各添加的成分浓度为其在无血清的ES培养液中的终浓度，所述双抗是指同时含有青霉素和链霉素两种抗生素的试剂。