[发明专利]一种提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法

说明书

提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法：用七种含有碳纳米管或石墨烯量子点的培养基依次对早梨茎尖进行处理，可显著提高茎尖的冻后成活率。本发明与现有技术比较，早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果好、成活率高、茎尖易再生。

技术领域：

本发明涉及一种提高植物茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法，确切地说是一种提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法。

背景技术：

上饶早梨产自上饶县，属于亚洲梨之一，有六月雪、黄皮消等多个地方主栽品种。上饶县花厅镇和田墩镇种植的早熟梨品质更优，具有表皮细薄、肉质脆嫩、核少汁多、味道香甜等特点，曾被列为贡品。2012年，上饶早梨获得国家农产品地理标志产品。超低温保存是目前植物种质资源有效、安全、稳定、经济、长期保存的方法。包埋玻璃化法超低温保存是在玻璃化法和包埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质资源的新技术，兴起于20世纪90年代中期，具有对材料的毒害作用小，设备简单、易于操作，材料处理简单等优点，在植物种质资源的保存上具有较大的发展前景。目前该方法已成功应用在桃、苹果、李和柿等多种果树上。但包埋玻璃化法超低温保存也存在成活率低、保存效果不佳等问题。针对这些问题，本发明开发了一种提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法，可为上饶早梨种质资源的长期保存提供技术基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成活率高、茎尖易再生的提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法。实现本发明目的的技术方案是，一种提高早梨茎尖包埋玻璃化法超低温保存效果的方法，其特征在于有以下步骤：(1)在超净工作台内，切取早梨茎尖并将其接种于液体培养基一：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+3％(w/v)海藻酸钠+0.3M蔗糖；(2)吸取茎尖转移到液体培养基二：0.4M蔗糖+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+0.1M CaCl₂，进行常规包埋；(3)将包埋珠转移到液体培养基三：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+0.5M蔗糖，进行常规预培养；(4)将包埋珠转移到液体培养基四：PVS2+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+0.4M蔗糖，进行常规脱水；(5)将包埋珠转移到冻存管的液体培养基五：PVS2+0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点，进行常规液氮保存；(6)液氮保存后，包埋珠经过常规化冻后转移到液体培养基六：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+1.2M蔗糖，进行常规洗涤；(7)将包埋珠转移到固体再生培养基七：MS+1-2mg/L噻苯隆+0.1-0.3mg/L NAA+0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，接种后将材料放入培养室进行常规条件培养，可显著提高茎尖的冻后成活率。

具体实施方式：

结合下述实施例对本发明作进一步说明：

(1)第一次处理

在超净工作台内，切取早梨茎尖并将其接种于液体培养基一：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+3％(w/v)海藻酸钠+0.3M蔗糖；

(2)第二次处理

吸取茎尖转移到液体培养基二：0.4M蔗糖+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+0.1MCaCl₂，进行常规包埋；

(3)第三次处理

将包埋珠转移到液体培养基三：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+0.5M蔗糖，进行常规预培养，预培养条件为：温度25±2℃，光照时间16h/d，光强1500-2500lx；

(4)第四次处理

将包埋珠转移到液体培养基四：PVS2+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+0.4M蔗糖，进行常规脱水；

(5)第五次处理