[发明专利]一种免疫细胞的分离方法及其应用

说明书

本发明具体公开了一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2‑4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2‑6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液以及其他离心计数步骤。本发明釆集外周全血分离免疫细胞，(1)避免大量釆集白细胞，可能会造成的大规模污染和细胞浪费；(2)操作简单可行；避免了患者反复抽血；(3)保证每次治疗用细胞都是新鲜分离的，避免了冻存对细胞的损伤。

技术领域

本发明涉及免疫细胞分离技术领域，具体地，涉及一种免疫细胞的分离方法及其应用。

背景技术

免疫监视学说是指：机体免疫系统通过细胞免疫等机制能识别并特异地杀伤突变细胞，使突变细胞未形成肿瘤之前即被清除，但当机体免疫监视功能不能清除突变细胞时，则可形成肿瘤。美国免疫学家在其研究论文中报道了在小鼠脾脏中发现的一种具有独特形态特征的细胞，与淋巴细胞、粒细胞和巨噬细胞不同，其胞体较大，呈现放射性的星状和树突样结构，故将其命名为树突状细胞(Dendritic cell，DC)。

DC是人体内的移动哨兵，它们分布于各种组织，非成熟在外周组织捕获和处理抗原，在其细胞表面呈现大量的抗原肽复合体分子，并上调共刺激分子的表达，从而逐渐成熟并迁移到二级淋巴器官，如脾和淋巴结，与其中的细胞接触并激活抗原特异的细胞。无论是单独疫苗的主动免疫治疗、的过继性免疫治疗，还是常规治疗后联合这两种方法进行的辅助治疗，在肿瘤的免疫治疗中，都显示了广泛的应用潜力。因此，国内外都开展了和的临床试验，以期在肿瘤免疫治疗效果上获得实验依据，为肿瘤的免疫细胞临床治疗奠定基础。

因此，急需开发一种从外周血中快速分离到活性高且数量大的DC。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供一种免疫细胞的分离方法及其应用，以解决上述的技术问题。

本发明是通过以上技术方案予以实现的：

一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：

S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2-4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；

S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2-6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；

S3.4℃低温离心，第1-10min，1000rpm，上下加速度均为0；第11-30min，2000rpm，上下加速度均为0；

S4.离心结束后，离心管中液体明显分层，从上到下依次为血浆与培养基混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层，用移液器小心吸取白膜层置于新的离心管，尽量不要吸到其他层，补充培养基，并用移液器轻轻混匀；

S5.4℃低温离心，第1-15min，1000rpm，上下加速度均为9；第16-30min，1500rpm，上下加速度均为9；

S6.去除上清液，保留细胞沉淀，补充等量培养基，并用移液器轻轻混匀，离心洗涤细胞，4℃低温离心，800rpm，1min，上下加速度均为9；

S7.重复步骤S6两次；

S8.去除上清液，补充等量的培养基，轻轻充分打匀后，用精确10ul量程的移液器吸取10ul细胞悬液，置于一250ul的离心管，随之在管中加入台盘蓝10ul，用移液器充分混勻，台盼蓝染色5min，取10ul细胞悬液均速冲池入血细胞计数板，倒置相差显微镜10倍目镜下计数；分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数；

优选地，步骤S8所述的细胞计数中，所述免疫细胞总数和存活率计算按以下公式：