[发明专利]一种重组表达载体、重组表达宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法

说明书

本发明属于生物工程领域，涉及腺苷三磷酸的制备。本发明提供了一种重组表达载体以及包含所述载体的重组表达宿主，所述重组表达载体包含编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸；本发明还提供了使用所述重组表达宿主合成腺苷三磷酸的方法。本发明通过使用所述重组表达宿主全细胞催化合成腺苷三磷酸，提高了腺苷转化率、ATP产率和反应效率，同时反应体系组分简单、成本低。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及腺苷三磷酸的制备。

背景技术

腺苷三磷酸(ATP)是生物体内重要的代谢物质，分子量为507，分子式为C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃，作为代谢中间体、辅酶和能量供体参与生物体内多种生化反应，是生命活动及生化反应所必需的高能化合物；在体外，ATP常作为酶反应的辅底物应用于工业产品如谷胱甘肽的生产。在临床上，ATP也常用于进行性肌肉萎缩、心肌梗塞、心肌炎等疾病的辅助治疗。

合成ATP的方法主要有化学合成法、生物酶催化法、微生物酶系发酵等。目前用于工业化生产的方法主要是以腺苷或腺苷一磷酸(AMP)作为底物，利用酵母菌糖酵解途径中的酶系合成ATP，但是该法存在着反应体系复杂、分离纯化困难、反应过程不易控制、产品批次间质量差异大等问题。

酶催化法相比发酵法而言，具有高效稳定、反应体系简单、反应过程容易控制等优点。如Akihiko MARUYAMA等(Akihiko MARUYAMA,Tatsuro FUJIO.ATP Production fromAdeine by a Self-coupling Enzymatic Process:High-level Accumulation underAmmonium-limited Conditions,Biosci,Biotechnol,Biochem.,65(3):644-650)报道了以腺嘌呤为底物，在产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)催化下合成ATP，反应28h后积累的ATP量达到117mmol/L，底物转化率达到82％。专利申请CN 106191170A公开了分别构建表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶的重组菌株，经提取或纯化后，三种酶以游离酶或固定化酶形式转化腺苷，生成ATP。

然而，在ATP合成领域，对于具有高底物转化率、高ATP产率、高反应效率，同时反应体系组分简单、成本低的方法仍存在需求。

发明内容

本发明的目的在于提高ATP合成的底物转化率、ATP产率，提高反应效率，同时简化反应体系组分，以便于操作和后续分离纯化、节约成本。为实现以上目的，本发明提供了一种包含编码腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和乙酸激酶(ACK，EC 2.7.2.1)的多核苷酸的表达载体以及相关宿主；以及利用所述宿主细胞全细胞催化合成腺苷三磷酸的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：

第一个方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包含编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸。

其中，编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸可以以任何合适的方式存在于表达载体中，如位于不同的操纵子中，或位于同一操纵子中。在特定的实施方式中，分别编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸在同一操纵子中顺序排列。所述顺序排列表示三种酶的多核苷酸在同一操纵子中在启动子之后依次排列，三者顺序不唯一，可以按照实际要求或操作而定。