[发明专利]一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌

说明书

本发明公开了一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及发酵工程技术领域。本发明以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BBE11‑1)来源的角蛋白酶基因为目的基因，pP43NMK为表达载体，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主，成功构建了可高效表达角蛋白酶的基因工程菌Bacillus subtilis WB600‑pP43NMK‑ker；同时，本发明对以该工程菌作为生产菌株生产角蛋白酶时的发酵培养基以及发酵条件进行了深入的研究，得到了一种可增加角蛋白酶产量的发酵培养基以及发酵生产角蛋白酶的最佳工艺。

技术领域

本发明涉及一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及发酵工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一种能够降解不可溶的硬质蛋白--角蛋白类底物(例如羽毛、羊毛、头发、皮屑等)的特异性蛋白酶，其主要由细菌、真菌、放线菌等微生物在以角蛋白为单一碳氮源时生长分泌获得。

作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，角蛋白酶可以替代传统蛋白酶，广泛应用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等领域，具有巨大的市场。

但是，野生角蛋白酶的性能拙劣、产量低下，远远不能满足市场需求，因此，它很难被真正应用于工业化生产中。

现在，常常采用基因工程菌的手段，强化角蛋白酶基因的转录和翻译，达到在菌中高效表达和活性分泌角蛋白酶的目的，以期能够有效提高角蛋白酶的性能和产量，但是，现阶段仍旧未能成功构建出可高效表达角蛋白酶的基因工程菌。

目前，角蛋白酶的异源表达宿主主要有三种菌，它们分别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母。大肠杆菌虽然遗传背景清晰，表达操作简单，但是采用T7强启动子时，大肠杆菌表达系统容易形成包涵体，造成角蛋白酶产量低下；毕赤酵母的发酵周期长，且往往因为密码子偏好性和酶分子糖基化等因素，阻碍了角蛋白酶的高效生产；而用枯草芽孢杆菌表达角蛋白酶时，虽然成功进行了表达，但是，角蛋白酶产量极为低下且活性几乎不可见。

因此，急需构建一种可高效表达角蛋白酶的基因工程菌以满足市场需求。

发明内容

为解决上述问题，本发明以食品安全性菌株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis BBE11-1)来源的角蛋白酶基因为目的基因，pP43NMK为表达载体，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为表达宿主，成功构建了可高效表达角蛋白酶的基因工程菌Bacillus subtilis WB600-pP43NMK-ker；同时，本发明对以该工程菌作为生产菌株生产角蛋白酶时的发酵培养基以及发酵条件进行了深入的研究，得到了一种可增加角蛋白酶产量的发酵培养基以及发酵生产角蛋白酶的最佳工艺。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为角蛋白酶基因(ker)；所述表达载体为pP43NMK；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因(ker)来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BBE11-1)。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因(ker)的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。