[发明专利]恶性心律失常的筛查试剂盒、动物模型的建立方法及应用

说明书

本发明提供了恶性心律失常的筛查试剂盒、动物模型的建立方法及应用。本发明在有家族性心源性猝死史的患者家系中检测到1个RyR2突变位点(p.A690E)并确认，进一步应用转基因动物模型，成功地构建了基因敲入小鼠，用小鼠模型验证了该突变可以导致猝死和室性心动过速的表型，还进一步应用生物化学、电生理、细胞和结构生物学等方法探讨了突变对钙通道结构和功能的影响，揭示了突变致儿茶酚胺敏感性多形性心室心动过速(CPVT)发病的分子机制。本发明为CPVT的治疗以及猝死的预防提供了新的思路，可应用小鼠模型筛选治疗心律失常的药物。

技术领域

本发明涉及生物医学的疾病诊断技术领域，具体地说，涉及诱发恶性心律失常的RYR2基因突变位点的鉴定、检测、动物模型的建立及其在药物筛选中的应用。

背景技术

心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)是指由于心脏原因所导致的突然死亡，它既可以发生于已知心脏病的患者中，也可发生在从无心脏病历史的健康人。心源性猝死常以突然丧失意识为表现。死亡通常在急性症状出现后1小时内发生，但是也有少数心脏骤停后存活者的死亡可超过此时限。在发达国家，心源性猝死是突然自然死亡的最常见原因。在美国，与心血管疾病有关的死亡大约占死亡人口总数的三分之一，而心源性猝死约占心血管死亡率的30％～40％。在中国，心血管疾病的发病率目前尚低于西方发达国家，但近些年来发病率上升很快。根据2009年发表的一项中国心源性猝死的流行病学调查报道，心源性猝死约占总死亡的9.5％，发生率约为41.8例/10万人口。如果以13亿人口推算，在中国心源性猝死的人数每年应高达54万。

大多数的心源性猝死发病于既有心血管病史的病患中，尸体解剖可见心血管结构异常(肥厚型心肌病、冠状动脉异常、心肌炎等)，然而一部分心源性猝死的尸检并未发现心血管有结构性异常，因此通常归类为原因不明性猝死。这一现象在国内的心源性猝死统计调查中也有发现，将近半数心源性猝死病例(43.5％的男性和42.3％的女性)生前并无明确心血管疾病病史(高血压、心绞痛、心肌梗死和心力衰竭等)。应用分子遗传学的方法分析原因不明性猝死，发现这类心脏结构无异常的猝死和人类RYR2基因上的突变相关，每7例原因不明性猝死中就有1例与RYR2基因变异相关。

人RYR2基因编码2型ryanodine受体，这一受体是心肌细胞中胞浆肌质网膜上钙离子释放通道。钙离子是各种细胞信号通路中最为重要的第二信使。在心脏中，钙离子调节心肌细胞收缩、调节心率以及调节细胞生长发育。在心肌细胞的兴奋-收缩偶联中，RyR2发挥至关重要的角色：兴奋信号传导至神经肌肉节点时引起肌细胞质膜去极化，电位变化沿质膜传导入心肌细胞深处，激活RyR2使其钙离子通道开放，胞浆肌质网中的钙离子释放到肌质中，结合肌钙蛋白引起肌丝构象变化，拉动肌丝滑动使心肌发生收缩。当RyR2通道关闭，肌质中的钙离子通过肌质网上ATP依赖的钙泵转运回肌质网中，肌质中的钙离子浓度随之降低，钙离子从肌钙蛋白上解离，使肌丝恢复原来的构象，引起肌纤维的舒张。

人类RYR2基因上第一个突变发现于2001年，迄今为止，大约有超过150例基因突变位点被识别出与2类遗传性心源性猝死相关：一类是儿茶酚胺敏感性多形性心室心动过速(catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia，CPVT)，另一类是2型致心律失常型右心室发育不良(arrhythmogenic right ventricular dysplasia type 2，ARVD2)。CPVT是一种遗传性心律失常，患者常在运动、疲劳或精神紧张时出现心室性心律失常，多为双向性室速，并可恶化为室颤进而导致心源性猝死，患者心脏结构多无明显异常。CPVT是青年人中原因不明性猝死的一个重要病因。ARVD2是一种遗传性心肌病，其特征为右心室心肌纤维发生病理改变导致右心室心肌薄弱，致使右心室室性心动过速反复发生造成昏厥并最终导致猝死。作为遗传性疾病，二者都是常染色体显性遗传病。