[发明专利]用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用

说明书

本发明公开了用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用，涉及基因编辑技术领域。该组合物包括第一载体和第二载体,第一载体包括5’‑3’的式(I)结构:P_II‑X1‑L1‑X2‑PolyA；第二载体包括5’‑3’的式(II)结构：P_III‑Y1‑P_II‑Y2‑L2‑Y3或Y4或Y5‑L3‑Y4‑PolyA；该组合物可对靶序列上的更宽的位置上的碱基进行修饰，具有较广阔的核苷酸修饰空间。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体而言，涉及一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

利用CRISPR/Cas9技术与胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶融合而成的单碱基基因编辑技术，分别可实现基因组上定点的C/G到T/A(简称CBE)，A/T到G/C(简称ABE)单碱基的突变。单碱基基因编辑技术，是基于Cas9n(D10A)与胞嘧啶脱氨酶或者腺苷脱氨酶融合而成，因此，其除了依赖Cas9识别PAM(例如NGG)外，存在一个“工作窗口”。若spCas9n融合，则它的工作窗口则是距离PAM远端数起4-9位，且在5-7位比较高效地实现基因编辑；若saCas9n融合，则它的工作窗口则是距离PAM远端数起4-12位，且在10-12位比较高效地实现基因编辑。因此，其工作窗口也影响了在基因组上的可编辑的空间，极大的限制了单碱基基因编辑系统应用范围。

因此，本领域迫切需要一种具备较广的工作窗口的单碱基基因组编辑系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核苷酸序列修饰的组合物，采用该组合物可以对核苷酸序列进行修饰，且具有较广的修饰区域，可以对PAM序列上游的第3-16位区域更广范围内的核苷酸进行修饰，具有较广的应用前景。

本发明的另一目的在于提供上述组合物在在基因突变、基因修复、构建有基因突变导致的疾病动物模型、基因治疗、基因功能筛选、药物筛选或疾病诊断等领域中的应用。采用本发明的组合物，可以针对感兴趣的基因组的目标区域进行修饰。

本发明的另一目的在于提供一种修饰核苷酸序列的方法，采用该用该方法可以对PAM序列上游的第3-16位区域范围的核苷酸核进行修饰，具有较广的核苷酸修饰区域和更广泛的的应用前景。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于核苷酸序列修饰的组合物，其其包括：第一载体和第二载体；

其中，所述第一载体包括5’-3’的式(I)结构：

P_II-X1-L1-X2-PolyA 式(I)；

式(I)中，P_II为II型启动子；X1为突变型Cas9(D10A)核酸酶的编码序列；X2为多肽表位的编码序列，L1为无或连接序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

其中，所述第二载体包括5’-3’的式(II)结构：

P_III-Y1-P_II-Y2-L2-Y3或Y4或Y5-L3-Y6-PolyA 式(II)；

式(II)中，P_III为III型启动子；Y1为sgRNA的骨架序列；P_II为II型启动子；Y2为多肽表位的单链抗体结合域的编码序列；L2为无或连接序列；Y3为胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合编码序列；Y4为野生型腺苷脱氨酶与突变型腺苷脱氨酶融合编码序列；Y5为Y3与Y4融合编码序列；L3为自剪接多肽2A；Y6为筛选标记蛋白表达序列；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。