[发明专利]一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及其制备方法和应用，测定试剂包括反应试剂A和反应试剂B，其中，反应试剂A为质量分数2％间苯二酚溶液2.5mL、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μL、25％盐酸溶液20mL，加水稀释至100mL而成；反应试剂B为16mL乙酸丁酯与4mL丁醇混匀配制成的乙酸丁酯‑丁醇液。本发明的测定方法可以间接比较不同菌株之间侵染宿主的毒力水平，克服现有通过宿主攻毒实验方法检测菌株毒力水平工作量大、需要多次重复、周期长的缺点。本发明检测快速、特异性强，适用于对菌株流行病学检测强弱毒株的初步筛选工作。

技术领域

本发明涉及一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及其制备方法和应用。

背景技术

大部分细菌入侵机体可引发宿主广泛的免疫反应，免疫细胞通过抗体或补体调理作用对其进行吞噬与清除。但在长期对宿主的适应、互作与进化过程中，细菌获得多个可对抗宿主调理吞噬杀灭作用的毒力决定因子，唾液酸化荚膜多糖(capsularpolysaccharides,CPs)就是其中之一，如II型猪链球菌(Streptococcus suis Serotype2)、大肠杆菌K1(Escherichia coli K1)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)和人源III型无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等细菌都有这种毒力因子。细菌荚膜多糖一般都由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸(sialic acid,Sia)4种单糖以不同排列方式构成不同重复单元。它们都有一个共同点-聚糖末端都带有一个以α2-3、α2-6或α2-8等连接方式结合在半乳糖上的唾液酸，荚膜多糖末端所带的唾液酸化聚糖(如Neu5Ac_α2-3Gal_β1-4GlcNAc)，与哺乳类免疫细胞表面糖蛋白末端的唾液酸多糖相似。动物体内与免疫应答相关的几乎所有关键分子(如抗体)及一些重要激素都是糖蛋白。这些糖蛋白在体内唾液酸转移酶修饰作用下具有不同的唾液酸化聚糖末端，用于与特定受体结合调节免疫反应。细菌利用其唾液酸化荚膜多糖模仿动物体内糖蛋白唾液酸化聚糖末端，与宿主细胞受体唾液酸结合型免疫球蛋白凝集素(Sialicacid-binding Ig-like lectins)结合，通过凝集素胞内区的抑制性信号结构域，启动宿主免疫负调控信号，从而逃脱宿主的免疫防御，引发全身性感染。

对GBS、肺炎链球菌与2型猪链球菌等细菌的研究均发现，通过基因敲除的方法使细菌的荚膜多糖唾液酸含量降低，通过感染宿主实验均发现会导致菌株的毒力显著降低。通过回复突变或转入突变基因，使荚膜唾液酸的含量恢复到野生株的水平，菌株毒力也恢复至野生株水平。因此，通过检测测定同种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量，可以间接比较不同菌株之间侵染宿主的毒力水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提出一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂，包括反应试剂A和反应试剂B，其中，反应试剂A为质量分数2％间苯二酚溶液2.5mL、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μL、25％盐酸溶液20mL，加水稀释至100mL而成；反应试剂B为16mL乙酸丁酯与4mL丁醇混匀配制成的乙酸丁酯-丁醇液。

一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、配制反应试剂A(显色剂)：称取间苯二酚粉末加双蒸水配制成质量分数为2％间苯二酚溶液；称取五水硫酸铜晶体加双蒸水配制成0.1mol/L硫酸铜溶液；称取质量分数为36％浓盐酸加双蒸水配制成20％盐酸溶液；分别量取质量分数2％间苯二酚溶液2.5mL、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μL、25％盐酸溶液20mL，加水稀释至100mL，混匀，4℃避光保存备用；