[发明专利]一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法

权利要求书

1.一种基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，准备检测样品，所述检测样品为尿液、血液、牛奶中的其中一种；

S2，设计合成适配子，将生物素化后的适配子配制成10μmol/L的适配子溶液，然后用结合液以体积比1：250-4000稀释，得适配子反应探针溶液，该适配子的核酸序列为：

5’-tggtcccatgtacgccgcggtgtacctccgcgtgtacgctactttctgtgcgtgctgagcgtgaattcgc-3’；

S3，将S1中检测样品加入到抗原预包被处理后的微孔中，以每个微孔中的检测样品为基础样品，然后加入与基础样品等体积量的S2中的适配子反应探针溶液，混匀后37℃孵育1h；

S4，用洗涤液洗S3的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的用结合液稀释了1000倍的HRP标记链酶亲和素，37℃孵育0.5-1.5h；

S5，用洗涤液洗S4的微孔3-5次，然后加入相当于S3中基础样品2倍体积量的邻苯二胺底物溶液，放置10-15min，然后加入相当于S3中基础样品等体积量的2mol/L的H₂SO₄，振荡混匀，得待检溶液；

S6，将S5中待检测溶液置于酶标仪上读取492nm波长下的吸光度值数，再对照标准曲线计算得检测样品中N-羟乙酰神经氨酸含量。

2.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中尿液是通过如下预处理步骤所得：量取原尿液，4℃、3000g条件下离心10min，取上清液并浓缩10倍，得尿液浓缩液，加入相当于9倍尿液浓缩液体积的0.06mol/L H₂SO₄，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。

3.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中血液是通过如下预处理步骤所得：量取原血液，37℃下水浴2h，4℃下过夜后3000g条件下离心15min，取上清液并浓缩10倍，得血液浓缩液，加入相当于9倍血液浓缩液体积的0.06mol/L H₂SO₄，80℃中水浴2h，冷却，用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0。

4.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S1中牛奶是通过如下预处理步骤所得：

B1，量取牛奶原液，4℃、3000g条件下离心30min，弃上层油脂，加入相当于牛奶原液1.5倍体积的质量浓度为10％的三氯乙酸，混匀并置于冰上10min，然后3000g离心30min，保留上清液和沉淀；

B2，在B1中离心后的沉淀中加入与牛奶原液等体积的质量浓度为5％的三氯乙酸，混匀，4℃、3000g条件下离心20min，保留上清液和沉淀，取上清液并与B1中的上清液合并，加入与合并后的上清液等体积的0.1mol/L的H₂SO₄，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶；

或者，在B2中离心后的沉淀中加入相当于牛奶原液3倍体积的0.1mol/L H₂SO₄，80℃中水浴2h，冷却，然后用质量浓度为1％的NaOH调节pH至5.0，得S1中牛奶。

5.如权利要求1所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，S2中结合液按照以下方法配制：20mmol Hepes、120mmol NaCl、5mmol KCl、1mmol CaCl₂、1mmol MgCl₂，蒸馏水定容至1L。

6.如权利要求5所述的基于适配子检测N-羟乙酰神经氨酸含量的方法，其特征在于，所述洗涤液按照以下方法配制：向S2中结合液加入吐温20，并使吐温20在洗涤液中质量比为0.05％。