[发明专利]LRR受体激酶的底物寻找方法

权利要求书

1.一种LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，包括：

S1：将LRR受体激酶与ATP-γ-S进行孵育，得到第一混合物；

S2：将所述第一混合物与富含所述LRR受体激酶的组织的总蛋白进行孵育，得到第二混合物；

S3：将所述第二混合物与对硝基苄基甲磺酸酯进行孵育，得到第三混合物；

S4：去除所述第三混合物中的对硝基苄基甲磺酸酯，得到第四混合物；

S5：将所述第四混合物用预处理的protein G琼脂糖进行孵育，离心得到第一上清液；

S6：将与protein G琼脂糖偶联的抗硫代磷酸酯的单克隆抗体与所述第一上清液进行孵育，得到第一沉淀物；

S7：对所述第一沉淀物进行分析，确定所述LRR受体激酶的底物；

其中所述LRR受体激酶为拟南芥LRR受体激酶PXY。

2.根据权利要求1所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述将LRR受体激酶与ATP-γ-S进行孵育的方法为：混合LRR受体激酶、CLE41、ATP-γ-S和激酶缓冲液进行孵育；其中所述CLE41的序列为HEV^HyPSG^HyPNPISN，其中所述^HyP为4-羟基脯氨酸。

3.根据权利要求2所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述孵育在25-35℃条件下震荡孵育25-35min，其中所述震荡的频率为16-20rpm；和/或

所述LRR受体激酶、CLE41、ATP-γ-S的浓度分别为10μM、10mM和1mM，所述混合的10μMLRR受体激酶、10mM CLE41、1mM ATP-γ-S和激酶缓冲液的体积比例为20:8:1:21；所述激酶缓冲液包含25mM Tris-HCl、0.5mM DTT、10mM MgCl₂和0.225mM十二烷基-β-D-麦芽糖苷，并调节pH为7.5。

4.根据权利要求1所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述将LRR受体激酶与ATP-γ-S进行孵育的方法为：混合LRR受体激酶、ATP-γ-S和激酶缓冲液进行孵育。

5.根据权利要求4所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述孵育在25-35℃条件下震荡孵育25-35min，其中所述震荡的频率为16-20rpm；和/或

所述LRR受体激酶、ATP-γ-S的浓度分别为10μM和1mM，所述混合的10μM LRR受体激酶、1mM ATP-γ-S和激酶缓冲液的体积比例为20:1:29；

所述激酶缓冲液包含25mM Tris-HCl、0.5mM DTT、10mM MgCl₂和0.225mM十二烷基-β-D-麦芽糖苷，并调节pH为7.5。

6.根据权利要求1所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述富含所述LRR受体激酶的组织的总蛋白的制备方法为：向富含所述LRR受体激酶的组织中加入组织裂解液以裂解所述组织，离心取上清液得到富含所述LRR受体激酶的组织的总蛋白。

7.根据权利要求6所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述向富含所述LRR受体激酶的组织中加入组织裂解液之前，事先用液氮研碎所述组织；和/或

所述组织裂解液包含25mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM DTT、10mM MgCl₂、0.1％SDS、25μMEDTA、2％(w/v)PVPP、1×蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂，其中所述蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂均为广谱类酶抑制剂。

8.根据权利要求6或7所述的LRR受体激酶的底物寻找方法，其特征在于，所述组织裂解液加入之前事先在冰上预冷；和/或

所述组织与所述组织裂解液的量的比例为1g：(2-4)ml；和/或

所述向富含所述LRR受体激酶的组织中加入组织裂解液之后，震荡混匀。