[发明专利]改性海藻酸钠水凝胶及其制备的细胞培养基质材料和应用

说明书

本发明公开了一种改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；本发明还提供了由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2‑磷酸‑L‑抗坏血酸在内的无血清培养添加物，以及在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。模拟正常干细胞在机体内生长环境，从原代培养开始获得人干细胞，具有更好的增殖活力、生物学特性和体内存活能力。这些改性海藻酸钠水凝胶的细胞培养基质材料、及其细胞培养器和无血清培养添加物，在低氧浓度条件下用于人干细胞原代和传代培养、干细胞的生物制剂，以及治疗疾病的药物组合物。

技术领域

本发明涉及一种改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，与含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸在内的无血清培养添加物，在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。特别地，模拟正常干细胞在机体内生长环境，从原代培养开始获得人干细胞，具有更好的增殖活力、生物学特性和体内存活能力。

背景技术

日前，在科研上和生产上干细胞的培养方法多数为简单塑料培养瓶或培养皿或培养板，加入含有细胞因子的培养基进行培养。干细胞多数为贴壁生长，坚硬的塑料瓶底不利于干细胞的生长，而且培养得到的干细胞生物学功能已发生较大的改变。于是人们开始尝试在塑料培养瓶或培养皿或培养板底部加入各种有利于干细胞生长的基质，如Matrigel基质胶、Geltrex基质胶、粘连蛋白、可溶性胶原蛋白、海藻酸钠和壳聚糖等，或者在微球上，利用它们存在的孔径和硬度用于干细胞三维培养，更好地展现出干细胞生物学功能。

还有研究者直接将干细胞包埋在凝胶内，再进行体外培养，尽管这种培养方式增加干细胞的增殖和抑制细胞凋亡，但干细胞扩增和传代培养增添了不少麻烦；不利于获得干细胞。

以上述方式获得三维立体环境，与真正体内细胞外基质的干细胞三维生长方式还相差甚远。细胞外基质除了有网状支架外，还需要网状支架上粘连的各种蛋白和细胞因子，以及生长环境等因素，共同营造干细胞最佳的生长条件。通过这种生长条件，干细胞增殖能力、抗凋亡能力、体内体外存活能力以及生物学功能均达到更好的状态，有助于其在体内发挥着更好的组织器官修复、改善机体微环境和分泌细胞因子的能力，达到真正意义上的治疗疾病的能力。

发明内容

本发明是我们研发团队经过多年的科研工作，模拟正常干细胞在体内生长的条件，包括细胞外基质、营养成分和氧浓度等因素，发明了改性海藻酸钠水凝胶，由可结合细胞因子的、且链霉亲和素修饰的纤连蛋白改性生物素偶联的海藻酸钠水凝胶制得；由其制备的细胞培养基质材料及其制备的细胞培养器，与含可溶性胶原蛋白、乳酸、维生素A和2-磷酸-L-抗坏血酸的无血清培养添加物，在低氧浓度条件下用于培养干细胞的方法。海藻酸钠作为支架，其偶联了生物素，制作成了活性的生物素-海藻酸钠水凝胶；生物素可特异性结合链霉亲和素，而链霉亲和素修饰了纤连蛋白，即形成了细胞外基质的基本框架。

由于纤连蛋白每个亚基具有六个功能区和一个RGD序列，使纤连蛋白能够和多种物质结合发挥强大的功能。纤连蛋白通过黏附细胞和营养物质，为细胞传输细胞代谢、生长、增殖所需的营养物质(比如可溶性胶原蛋白、透明质酸、小分子肽、糖蛋白等)，并调节细胞外的微环境。特别是纤连蛋白具有与抗体相似的结构域，在III型结构域存在可变区，可插入单克隆抗体的互补决定区，可与目的蛋白产生抗原抗体反应并特异性结合。利用这一特点，我们在III型纤连蛋白结构域进行基因重组插入小鼠抗人细胞因子的单链抗体，从而可以特异性结合细胞因子。同时利用I型和II型纤连蛋白结构域中特异性结合可溶性胶原蛋白的区域，加入可溶性胶原蛋白以特异结合纤连蛋白，形成近似细胞外基质的细胞生长环境。