[发明专利]一种表达R构型选择性的脂肪酶的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达R构型选择性的脂肪酶的重组菌及其应用，将R构型选择性的脂肪酶基因插入pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒；再将所述重组质粒转化大肠杆菌SHuffle T7，得到重组菌；所述R构型选择性的脂肪酶基因为如下1)或2)的DNA序列：1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列；2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有酯水解酶活性的蛋白的DNA序列。本发明重组的脂肪酶具有较高R‑构型立体选择性和催化活力，在较高温条件下酶活保留大于85％，可用于拆分外消旋2‑芳基丙酸甲酯类物质，获取光学纯的S‑型2‑芳基丙酸甲酯类物质。

技术领域

本发明涉及一种R构型选择性的脂肪酶AflB及其编码基因，以及含有该编码基因的载体、工程菌及其在手性拆分外消旋体2-芳基丙酸类物质的应用。

背景技术

脂肪酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用底物通常是脂肪酸链大于十个碳原子的酯类。脂肪酶能催化水解、酯化、转酯等多种化学反应，是一种很重要的工业催化剂。另外，脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值。

由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成或拆分手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。如2-芳基丙酸类非甾体抗炎药物具有解热、消炎、镇痛的作用，主要治疗风湿性脊椎炎、类风湿性关节炎及产后、术后止痛等，在临床上应用广泛。但是研究发现，2-芳基丙酸类物质存在一对光学活性对映体，而真正具有治疗作用的S-构型分子(例如(S)-萘普生的药效是(R)-萘普生的28倍，且(R)-萘普生与辅酶A会形成酯，扰乱人体正常的膜功能及脂代谢等，给人体带来一定的毒副作用)。因此，为了用药安全，在临床上须使用纯(S)-2-芳基丙酸。所以，研究一种高效、低成本酶法拆分2-芳基丙酸类物质的方法就变得非常重要。

酶法拆分手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。虽然脂肪酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化功能不一样，通过对微生物发酵产物的分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，往往需要较复杂的工艺和较高的成本，在生产中不易被采用。

发明内容

本发明的目的旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明需要提供一种R构型选择性脂肪酶以及含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种具有R-异构体立体选择性的脂肪酶AflB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

一种含有R构型选择性的脂肪酶AflB编码基因的质粒pET28a-AflB，R构型选择性的脂肪酶AflB编码基因序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2具有90％以上同源性且编码具有酯水解酶活性的蛋白的DNA序列，再通过全基因合成将上述脂肪酶基因克隆到pET28a质粒上得到质粒pET28a-AflB。

一种表达R构型选择性的脂肪酶的重组菌，通过将质粒pET28a-AflB转化大肠杆菌宿主菌E.coli Shuffle T7得到重组菌E.coli Shuffle T7/pET28a-AflB。

一种R构型选择性的脂肪酶AflB的制备方法，其中包括如下步骤：培养本发明所述的生产菌株E.coli Shuffle T7/pET28a-AflB，从培养物中获得重组R构型选择性的脂肪酶AflB。