[发明专利]核酸提取PCR扩增检测一体化解决方案

说明书

一种实现核酸提取及PCR扩增检测一体化的试剂盒及其测试方法，所述试剂盒包括核酸提取单元和PCR扩增检测单元，可以与配套仪器配合完成核酸提取和PCR扩增检测的全自动流程，过程中无需转板操作或人工干预，本发明的核酸提取及PCR扩增检测一体化的解决方案实现了真正的自动化、减少仪器成本、压缩全流程时间、避免核酸提取过程中的污染、提高核酸提取的纯度、加速PCR扩增流程，提高了实验的可靠性及实验效率。

技术领域

本发明涉及一种分子生物学分析的实验方法，特别涉及一种将核酸提取及PCR扩增检测结合在一起的一体化解决方案。

背景技术

核酸提取和PCR扩增检测是分子生物学中研究的重要实验手段，早期的实验都是纯手工完成，耗时较长、且实验结果容易受到实验人员个体操作差异的影响。随着自工业自动化的发展，在实验科学领域，传统的手工实验越来越多的被自动化设备所取代，自动化设备的可重复性及一致性减少了传统手工实验的误差，提高了实验的可靠性及实验效率。

【实验步骤】在实验步骤方面，一般的核酸分析过程基本都包括样本前处理、核酸提取和PCR扩增检测几个部分。样本前处理根据待检的样本不同，有离心、过滤、研磨等不同的处理方式，正是由于处理方式繁多，很难设计一种通用的样本前处理设备，故目前的现状在这个环节，基本都是借助离心机、温控器等通用的实验室设备半手工完成。核酸提取过程需要完成核酸的裂解及清洗纯化，常用的方法包括煮沸法、离心柱法和磁珠法等，由于磁珠法便于自动化集成，故目前自动化的核酸提取仪，采用的大多为磁珠法的核提方式。核酸提取后的样本尽管经过了洗脱浓缩，其浓度还是很低，大多还不能直接用来杂交进行后续分析，还需要经过PCR扩增放大、检测定量后再进行后面的环节。定量PCR仪即可完成PCR扩增及检测。可以看出，上述三个环节基本上都是不可或缺的。

【集成情况】需求就是发展的方向，在过往的十多年来，实现上述三个环节分立的自动化设备如样本制备仪、核酸提取仪及定量PCR仪，不断的推陈出新，占领市场。但把制备的样本加载到核酸提取仪、以及把核提后的样本加载到定量PCR仪进行扩增，这中间的转移操作环节还几乎全部需要实验人员手工完成。怎样打通这最后一个环节成为了研究的重中之重。近年来，也有厂商通过机械手、自动臂等方式替代了人手，完成了样本转移传递的工作，但几个分立设备加上机械臂的方式，使得系统及其的庞大复杂，造价极高，且一般需要批量实验运转，整个实验流程下来速度较慢。

【核酸提取情况】在核酸提取这个环节，传统的手工磁珠法实现方式使用磁力架，需要的试剂量较大，且提取过程复杂，耗时耗力。自动化的设备采用的方法大致为两种：一种是将传统手工方法自动化，在反应杯侧壁或底部设置磁性单元，通过自动化的移液装置将核酸提取过程需要的裂解液、清洗液及洗脱液逐步加入反应杯，吸排混匀后再移除废液。这种方法虽然节省了人力，实现了自动化，但在移除废液时，反应杯底部总是会残留一定的废液，导致核酸提取后的样本纯度不高。另一种是采用磁棒磁套的方法，该方法是在核酸提取的裂解、清洗和洗脱步骤中，使用磁棒及包裹在其外的磁套在不同的反应位进行移动及磁吸附，以达到核酸转移提取的目的。这种方法也实现了核酸提取的自动化，但磁套在转移过程中其上吸附的磁珠及液体容易滴落在仪器及反应杯中，会造成体系的污染。另外，采用此种方法洗脱液体积需求较大，不利于核提样本的浓缩，对于核提样本高浓度的需求不易实现。

【PCR扩增情况】一直以来，PCR的扩增时间都是以小时计算的，是分子诊断分析过程中时间最让人诟病的，要想实现分析过程的快速化，实现快检，就必须压缩PCR扩增的时间。而影响PCR扩增时间最大的因素是PCR反应体系的升降温速率。在这一点上，有人从仪器上解决，使用传导率高的如银质的传导模块；有人从试剂上解决，研究快速反应试剂、减小反应体系等；有人从耗材上解决，采用玻璃毛细管等。

【研究方向】怎样解决上面所述的三个步骤真正的自动化、减少仪器成本、压缩全流程时间、避免核酸提取过程中的污染、提高核酸提取的纯度、加速PCR扩增流程，是我们研究改进的主要方向。

发明内容