[发明专利]基于iTRAQ蛋白组学识别D-乳酸发酵过程中显著差异表达蛋白的方法

说明书

本发明涉及基于iTRAQ蛋白组学识别D‑乳酸发酵过程中显著差异表达蛋白的方法；在最优发酵工艺条件下利用L.delbrueckii进行D‑乳酸生产；提取和定量L.delbrueckii在最优发酵工艺条件下对数期胞内总蛋白；对提取和定量的胞内总蛋白进行酶解和同位素标签标记；对酶解和标记的肽段进行LC‑MS/MS检测；对检测的质谱数据进行数据库检索，进行蛋白的定性和定量分析；对定性和定量蛋白根据丰度进行差异表达蛋白分析，识别显著差异表达的蛋白。通过系统生物学，首次分析L.delbrueckii在不同发酵工艺条件下，高发酵D‑乳酸过程的胞内蛋白组轮廓，达到指导后续菌种提升和进一步发酵条件优化。

技术领域

本发明属乳杆菌系统生物学领域，涉及一种德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii，实验室保藏，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC1.2624)在最优发酵工艺条件下，采用同位素标记的绝对和相对定量(Isobaric tagsfor relative and absolute quantitation，简称iTRAQ)蛋白组学技术分析胞内蛋白组轮廓，识别D-乳酸高效发酵过程中显著差异表达蛋白的方法。

背景技术

D-乳酸分子式CH₃CHOHCOOH，相对分子量为90.08，CAS号：10326-41-7，是一种最为常见的代谢产物，在食品、化工、农业和医药等行业中的应用非常广泛，是三大传统有机酸之一。D-乳酸作为一个手性中心，是多种手性物质的前体，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。D-乳酸的另一个更为重要的用途是作为合成聚乳酸(PLA)材料的原料单体。聚乳酸近年来受到广泛关注的一种可再生、可回收的新兴塑料，是石油基塑料的潜在替代品。

蛋白质是细胞生命活动的“执行者”，为了从蛋白层面上系统揭示细胞生命活动的规律，在后基因组时代，蛋白组的概念应运而生，指的是一个细胞或者一个组织的基因所表达的全部蛋白质。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质；(2)多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果；(3)在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。基于同位素标记的绝对和相对定量蛋白组学技术，简称iTRAQ蛋白组学技术，是近年来兴起的蛋白组检测技术，相比于传统的二维凝胶电泳技术，具有定量准确、高通量(鉴定和定量蛋白数量远超二维凝胶电泳技术)、高灵敏度(可以检测低丰度蛋白)和检测范围广(不仅可以鉴定和定量胞质蛋白，还可鉴定和定量膜蛋白和核蛋白等)等优点。

目前关于iTRAQ蛋白组学技术的发明专利主要用于疾病治疗方面的。例如，南宁科城汇信息科技有限公司的于思创等人发明了一种将iTRAQ技术应用于骨关节模型研究的方法(一种iTRAQ标记在骨关节炎模型中的应用。公开号：CN107727728A)，对样本进行iTRAQ蛋白组分析，识别差异蛋白，分析差异蛋白在OA的系统网络中发挥的功能及可能的相互作用，筛选候选OA标志物。该发明通过人群样本进行标志物的确认，评估这些OA候选标志物诊断OA的价值并分析其与临床的相关性，提出它们在OA的预防、早期诊断等临床应用方面的可行性，及其在人群骨关节健康预警中的意义。北京邦菲生物科技有限公司的陈宁等人发明了一种将iTRAQ蛋白组学应用于肺癌和肺部结节疾病研究的方法(一种肺癌和肺部结节蛋白特征谱及其构建方法与应用。公开号：CN107449916A)，该发明分别从肺癌/肺部结节患者组和健康对照者组的血浆中提取总蛋白，胰蛋白酶酶解，iTRAQ标记，二维液相色谱和串联质谱检测，相对定量分析，获得肺癌/肺部结节相关蛋白特征谱；肺癌相关蛋白特征谱中，肺癌患者组和健康对照者组中表达差异的蛋白为上调蛋白(SAA1、SERPINA1、CRP、IGHG4和CFH)；肺部结节相关蛋白特征谱中，肺部结节患者组和健康对照者组中表达差异的蛋白为上调蛋白(SERPINA1和CRP)和下调蛋白(SAA1、IGHG4和CFH)。该发明有助于研究肺癌和肺部结节生物学本质，对肺癌和肺部结节规范分型有重要意义。