[发明专利]制备犬胎膜间充质干细胞的方法和犬胎膜间充质干细胞

权利要求书

1.从犬的胎膜制备间充质干细胞和冻存的方法，该方法包括以下步骤：

(1)消毒和清洗：将胎盘依次使用酒精以及生理盐水反复漂洗表面，对胎盘进行消毒处理；接着撕取胎膜，剔除血管后，使用磷酸缓冲液再次冲洗，去除表面污血、杂质；所述磷酸缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0；

(2)消化处理：将步骤(1)得到的胎膜组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理0.5-3小时，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；

(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液以密度0.2-2×10⁴/cm²加入培养容器中，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第3-6天时将培养容器从培养箱中取出，补加适量间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天进行一次全换液；

(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-70%以后，利用添加了0.05%w/v的1,2-丙二醇的消化酶TrypLE™ Express将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得P1代胎膜间充质干细胞；接着照上述培养方法进行传代；

(5)冻存：将步骤(4)所得胎膜间充质干细胞中以体积比1:1的量添加细胞冻存液，于液氮中冷冻，备用；

其中：

所述间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin、84重量份的DMEM-F12、0.025%w/v甘氨酸；

所述细胞冻存液包含65份的DMEM-F12 、10份的二甲基亚砜、15份的人血白蛋白。

2.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述消化酶溶液是将I型胶原酶加入DMEM-F12，通过过滤器过滤得到的。

3.根据权利要求1的方法，步骤(2)中所述消化酶溶液是将0.1g的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，用0.45µm过滤器过滤得到的。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为0.5-3小时。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为1-2.5小时。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为1.5-2小时。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，终止消化的间充质干细胞培养基是按照体积比2:1~1:2的比例加入。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，终止消化的间充质干细胞培养基是按照体积比1:1的比例加入。

9.根据权利要求1的方法，所述细胞冻存液中还添加右旋糖苷。

10.根据权利要求1的方法，所述细胞冻存液中还添加0.2~0.5%w/v右旋糖苷-40。

11.根据权利要求1的方法，所述细胞冻存液中还添加0.25%w/v右旋糖苷-40。

12.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)所述培养箱中CO₂浓度为3-7%，培养箱温度控制在34-40℃范围内。

13.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)所述培养箱中CO₂浓度为3-7%，培养箱温度控制在36-38℃范围内。