[发明专利]一种转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法，属于多组分生化药物质量研究领域。方法包括：1)利用核苷酸类物质对照品，用高效液相色谱法检测获得色谱图，构建标准曲线方程；2)将待检测的转移因子口服液制成供试品溶液，从色谱图中提取各核苷酸对应的色谱峰面积；3)根据步骤1)获得的标准曲线方程和步骤2)获得的色谱峰的面积，计算转移因子口服溶液中核苷酸类物质的含量。采用本发明的方法能够有效解决现有技术中仅能笼统的测定一类物质，且检测干扰物质多，检测结果重现性差的技术难题。经系统的验证研究该检测方法无其他物质干扰、专属性强、准确可靠，能有效地对转移因子口服溶液中游离核苷酸检测与监控。

技术领域

本发明属于多组分生化药质量分析研究技术领域，具体涉及一种转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法。

背景技术

转移因子(transter factor，简称TF)又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生，作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能提高动物机体细胞免疫功能。转移因子口服溶液是以口服为给药形式的免疫增强剂。转移因子属于多肽类物质，是由多核苷酸、多肽及其他成分组成的复合分子。其中小分子肽类物质及核苷酸类物质是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成分。因此，准确测定转移因子中的核苷酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

迄今为止，关于转移因子中核苷酸含量测定方法的相关报道，均是采用地衣酚法显色反应，以D-核糖为对照品检测。该方法的原理为地衣酚试剂与核苷酸降解产生的核糖反应生成糠醛显色，由D-核糖回归曲线计算核糖含量，但戊糖均有此反应，专属性不强；此外该法是根据与RNA中嘌呤碱基结合的核糖部分的显色反应，仅可检测核糖核酸(RNA)含量，不可检测脱氧核糖核酸(DNA)含量。由于转移因子溶液的提取方法，并非专一针对核糖核苷酸类物质，在提取过程中可能也存在大量脱氧核糖核苷酸类物质，但上述方法并未对此类物质进行测定和控制。

因此，可以看出，现有技术仅能笼统的测定一类物质，且检测干扰物质多，检测结果重现性差。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法，该方法具有准确性高、重现性好、操作简便的优势。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的转移因子口服液中核苷酸类物质的定量检测方法，包括以下步骤：

1)构建核苷酸类物质的标准曲线方程

精密量取各对照品核苷酸类物质制成贮备液，然后将贮备液制成构建标准曲线所需的对照品系列溶液；利用高效液相色谱法检测获得色谱图，以核苷酸类物质中各核苷酸浓度对色谱图中各核苷酸峰面积，按照最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程；其中，色谱检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中：流动相A为甲醇；流动相B为pH值为3.5～3.6的磷酸盐缓冲溶液；

检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μL，流速为0.6～1.0mL/min，柱温为33～37℃；

2)转移因子口服液中核苷酸类物质的检测

精密量取待检测的转移因子口服液制成供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤1)相同的色谱检测条件下获得色谱图，提取转移因子口服液中核苷酸类物质中各核苷酸对应的色谱峰面积；

3)转移因子口服液中核苷酸类物质的含量计算

根据步骤1)获得的标准曲线方程和步骤2)获得的色谱峰的面积，计算得到转移因子口服溶液中核苷酸类物质的含量。