[发明专利]HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型

说明书

本发明公开了HTT的CRISPR/Cas9‑gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型，涉及生物技术领域。本发明的打靶序列对包括L序列和R序列，L序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，R序列的碱基序列对如SEQ ID NO.2所示。本发明的打靶质粒包括第一载体质粒和上述的打靶序列对，打靶序列对构建至第一载体质粒中。本发明的HD细胞模型由PolyQ Donor质粒以及上述打靶质粒共转染细胞而得。本发明以分化的神经元细胞为载体构建HD细胞模型，为探索mHtt蛋白在影响或改变分化的神经细胞内环境方面的研究、分化的神经元细胞内由mHtt蛋白引起的各种信号通路、代谢通路及胞内稳态的变化提供了研究平台。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型。

背景技术

亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease,HD)是一种常染色体显性遗传病，其主要病灶在脑部，尚不清楚其确切的发病机制。HD在临床上主要表现为进行性的运动、认知及精神障碍，但最终导致患者死亡的原因大多都是并发症引起的。目前还没有有效的针对HD的治疗药物和方法，针对HD的治疗主要以缓解病症为主。在疾病的早期、病症不足以影响患者的日常生活时，通常是不需要药物的干预。当患者出现跌倒时，就要考虑药物干预治疗了，首选是多巴胺的消耗药物：四苯喹嗪，虽然其可能完全抑制过度运动，并可以有效地抑制HD的舞蹈样运动，但四苯喹嗪有加重HD患者抑郁的副作用。另外一方面，当患者出现严重的抑郁时，通常会首选抗抑郁的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂西酞普兰。针对HD患者的药物选择要根据患者当前的症状做出不断的调整。根据现在对HD的研究进展，研究者们正在尝试着不同治疗方式的探索。从最新的分子生物学技术领域大致可分为两个方向的探索：第一，试图利用最新基因编辑工具实现对病灶部位组织进行原位病态基因组DNA的纠正；第二、试图将源于病灶的组织细胞在体外进行基因纠正之后再重新输入到患者的病灶部位以期望再次输入的正常细胞能够改善或治愈病灶。

CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsCRISPR-associated Cas9)系统是第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(Zincfinger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)都可用于各种复杂基因组的定点编辑。改造后的CRISPR/Cas9载体是由gRNA作为引导序列与所编辑DNA以碱基互补配对的方式相结合，这样的方式极大的降低了脱靶的概率，然后gRNA的发卡结构所携带的Cas9蛋白在PAM的作用下识别相应碱基序列，切断DNA双链或单链。基于此种原理，CRISPR/Cas9基因编辑系统相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN系统，具有操作简单方便、效率高、成本低、同时沉默/敲出/突变任意数量的基因等优点。

基于CRISPR/Cas9技术的发展，有研究者利用CRISPR/Cas9技术已经完成了载体细胞HEK293和293F HD模型的构建。也有研究者利用CRISPR/Cas9成功的在YAC128转基因HD小鼠模型中实现了对mHTT基因表达的沉默以及基于HD 140Q-KI小鼠模型应用CRISPR/Cas9技术成功下调了mHtt在小鼠纹状体细胞中的表达量。说明CRISPR/Cas9在针对HD的模型构建和疾病发展的干预都有比较好的前景。目前，基于iPSCs和ESCs的HD细胞模型研究较多，但还没有基于分化神经细胞构建HD细胞模型的实验报道。基于iPSCs和ESCs的HD细胞模型研究的主要目的是试图将源于病灶的组织细胞在体外进行基因纠正之后再重新输入到患者的病灶部位以期望再次输入的正常细胞能够改善或治愈病灶(目前还没有试验成功的相关报道)。iPSCs和ESCs的HD细胞模型并不能完整反映HD的发病过程、及其发病过程中分化(功能)神经元细胞的内环境变化情况。又因HD是慢性的突变蛋白大量累积后才出现的严重神经疾病症状，其发病需要很长时间突变蛋白的积累且发病后患者一般会有15-20年的生存期，所以iPSCs和ESCs的HD细胞模型的实际应用受到了限制。