[发明专利]一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法

权利要求书

1.一种念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，其特征在于：包括一念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置，该念珠菌属真菌生物被膜流动模型装置包括一个用于容纳真菌培养基的第一容器、一蠕动泵、一个分液进样器、四个用于生物被膜孵育的第二容器和一个容纳流出液的第三容器；所述分液进样器设有一个进液孔，在所述进液孔的下方设有四个出液孔；所述第二容器的顶部设有顶部孔，底部设有底部孔；所述四个用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液进样器的进液孔通过管路与所述蠕动泵的出液口连通，所述蠕动泵的进液口通过管路与所述第一容器连通，所述分液进样器的出液孔分别通过管路与所述第二容器的底部孔连通，所述第二容器的顶部孔分别通过管路与所述第三容器连通；

所述制备方法包括下列步骤：

第一步：首先将念珠菌属真菌菌株接种于SDB培养基中进行孵育，然后离心收集菌细胞，接着用无菌PBS缓冲液清洗，收集的菌细胞重悬于RPMI-1640培养基中，再孵育12~18小时后得到真菌培养液；

第二步：对所述真菌培养液进行离心分离，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基至真菌细胞浓度为4-6×10⁶CFU/ml，得到重悬菌液；

第三步：将四个医用导管片放置到所述重悬菌液中，摇床孵育使菌体黏附到所述医用导管片上，然后取出所述医用导管片，用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗除去黏附不牢的真菌细胞，接着将所述医用导管片分别放置到所述第二容器内，所述第二容器内容纳有真菌培养基，静置培养1.5~2.5小时后打开所述蠕动泵，流动孵育19~20小时；

第四步：将第三步得到的医用导管片先用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液清洗，然后放入容纳有pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液的试管中，接着采用超声波处理至所述医用导管片上不含真菌细胞，收集得到含菌溶液；

第五步：将所述含菌溶液用pH值为7.2的无菌磷酸缓冲液稀释得到稀释液，然后将稀释液与XTT-维生素K3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波长下检测其OD值。

2.根据权利要求1所述的念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，其特征在于：每升所述真菌培养基含有400mg的氯化钾、6000mg的氯化钠、2000mg的葡萄糖、290.00mg的L-精氨酸、50mg的 L-天冬酰胺、20mg的L-天冬氨酸、65.15mg的L-胱氨酸二盐酸盐、20mg的L-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的L-组氨酸、20mg的L-羟脯氨酸、50mg的L-异亮氨酸、50mg的L-亮氨酸、40mg的L-赖氨酸、15mg的L-甲硫氨酸、15mg的L-苯丙氨酸、20mg的L-脯氨酸、30mg的L-丝氨酸、20mg的L-苏氨酸、5mg的L-色氨酸、23.19mg的L-酪氨酸、20mg的L-缬氨酸，100ml的质量浓度为10%的胎牛血清，其余为纯化水，然后用3-(N-玛琳代)丙磺酸调整pH值至7.0。

3.根据权利要求1所述的念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，其特征在于：每升SDB培养基含有10g蛋白胨，20g琼脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。

4.根据权利要求1所述的念珠菌属真菌生物被膜流动模型的制备方法，其特征在于：所述RPMI-1640培养基的原料配方包含下列质量百分比的原料：1%的甘露醇、1%的营养肉汤、0.2%的K₂HPO₄和1.35%的琼脂粉。