[发明专利]一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于先进行引物和探针设计，设计针对基因VI型新城疫病毒强毒株F基因的荧光RT-PCR扩增引物和探针，再提取待测样品核糖核酸，用扩增引物和探针进行荧光RT-PCR反应，根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有基因VI型新城疫病毒强毒株。

2.根据权利要求1所述的一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述的引物设计：选取II类新城疫强毒株和弱毒株的F基因序列，根据MEGA软件的核苷酸序列比对结果，其中II类新城疫强毒株包括基因III型、VI型、VII型、XII型，II类新城疫弱毒株包括有基因I型、II型；通过Primer Premier软件设计针对基因VI型新城疫病毒强毒株的上游引物、下游引物和探针，上游引物、下游引物扩增片段长度为223bp，探针5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团，引物和探针序列分别为：

上游引物：5’-CTCAGACAGGGTCAATCATAGT-3’；

下游引物：5’-GCAACCCCAAGAGCTACA-3’；

探针：5’-ATGAAGCGCTTCTGCCTCCTTCCTCC-3’。

3.根据权利要求2所述的一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ-1。

4.根据权利要求1所述的一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述的提取待测样品RNA是选用市售RNA提取试剂盒，或用TRIZOL裂解液处理待测样品，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA。

5.根据权利要求1所述的一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述的用特异性引物和探针进行荧光RT-PCR反应，反应体系如下：Taq Mix 0.5μL，2×Rection Mix 10μL，20pmol/μL的上游引物0.5μL，20pmol/μL的下游引物0.5μL，10pmol/μL探针0.5μL，RNA模板2μL，DEPC水6μL，总体积20μL；反应程序为：先在50℃反转录30min，再于95℃条件下预变性3min后，进行94℃15s，59℃1min，共进行45个循环，最后在59℃收集荧光信号。

6.根据权利要求1所述的一种基因VI型新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有基因VI型新城疫病毒强毒株，若样品出现扩增曲线，且Ct值≤35，判定为阳性，若样品出现扩增曲线，且35＜Ct值＜40，判定为疑似，若样品无扩增曲线或Ct值≥40，判定为阴性。