[发明专利]检测蟹爪兰X病毒所用PCR引物对、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了检测蟹爪兰X病毒所用PCR引物对、检测方法及其应用，该引物对包括上游引物SchVX CP‑F：5’‑GGTCATCACCGGAAACTGT‑3’，下游引物SchVX CP‑R：5’‑CTTTGGGCTTTCAGATCCTT‑3’。该PCR引物对能在检测火龙果、仙人掌及蟹爪兰是否存在蟹爪兰X病毒侵染中得到应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学与植物病毒检测技术领域，特别涉及一种检测蟹爪兰X病毒所用PCR引物对、检测方法及其应用。

技术背景

火龙果(Hylocereus undatus Britt.)作为一种典型的热带水果植物，属仙人掌科(Cactaceae)三角柱属(Hylocereus),近年来在我国南方各省发展迅速。上世纪90年代后期，大陆地区陆续开始引进火龙果种植，到2017年，我国火龙果种植面积约55万亩，其中贵州种植面积13.02万亩，为国内最大种植省。由于火龙果的繁殖方式主要为扦插繁殖，使得病毒病得以加速传播，贵州作为国内火龙果种植面积最大的地区，近年来调查发现，在田间病毒病感染症状明显，枝条表现斑驳黄化褪绿、花叶、畸形等各种症状，植株长势也逐渐衰退。在侵染火龙果的病毒病当中，蟹爪兰X病毒是火龙果上较为常见的一种，导致火龙果产量下降和品质变劣。然而，针对该病害，目前国内尚缺少较为有效的治疗措施，要控制病情扩散，首要任务是保障苗木无毒安全，而对于该病毒，国内报道较少，亦未建立完整的检测体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测蟹爪兰X病毒所用PCR引物对、检测方法及其应用，填补了国内在该领域的空缺，同时也能在生产上普遍运用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

首先，本发明提出了一种检测蟹爪兰X病毒所用PCR引物对，该引物对包括上游引物SchVX CP-F：5’-GGTCATCACCGGAAACTGT-3’，下游引物SchVX CP-R：5’-CTTTGGGCTTTCAGATCCTT-3’。

其次，本发明提出了采用该PCR引物对检测蟹爪兰X病毒的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1.提取待检火龙果样品的总RNA；

步骤2.逆转录；

步骤3.PCR扩增。

其中，步骤3中PCR反应体系配制如下：

25μL扩增反应体系如下：

10×PCR缓冲液，2.5μL；

25mmol/L MgCl2，1.5μL；

2.5mmol/LdNTP，2.0μL；

上游引物SchVX CP-F，2.0μL；

下游引物SchVX CP-R，2.0μL；

模板cDNA(1ng/μL)，2.0μL；

Taq DNA聚合酶，0.2μL；

无RNA酶去离子水，12.8μL。

PCR反应条件如下：在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增：1)94℃预变性5min；2)94℃变性40sec；3)55℃退火50sec；4)72℃延伸50s；循环步骤2)～4)30次；5)72℃延伸8min。

进一步的，对步骤3中PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与阳性对照相比，若待检样品的扩增条带长度与阳性对照一致，则待检样品呈阳性，表明样品中含有蟹爪兰X病毒。