[发明专利]一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法

权利要求书

1.一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；

第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；

第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测，根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。

2.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述第二步中延伸反应步骤为：取200-300μL捕获探针，与5μL 10mM dNTPs、1-2μL RNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应；所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括：延伸反应产物以2500-3000转，15分钟离心提纯1次；去除上清后，将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应；该混合液30℃振荡2-3小时，以2500g，15min离心提纯，去除上清液，将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。

3.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述捕获探针的制备方法包括如下步骤：

配制10mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，取10-20μL 10μM TS Primer(端粒酶引物，序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中，再分别加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液，加入50-60μL掺杂FITC(异硫氰酸荧光素)的二氧化硅纳米球溶液，置于摇床中振荡反应12-16小时；将反应物以2500-4000转，15分钟离心1-2次提纯；去除上清，沉淀分散于2mLPBS溶液中，即得到捕获探针。

4.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述掺杂FITC的二氧化硅纳米球的制备方法包括如下步骤：

在1mL无水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后获得FITC-APTMS(偶联了APTMS的FITC)，该产物保存于4℃待用；之后，在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水，1.5-2mL 98％TEOS(正硅酸四乙酯)和100-120μL的FITC-APTMS，在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL 25％氨水，反应3-3.5小时后加入1mL 98％TEOS，继续反应三小时；将反应产物以3000-5000转，15分钟离心3-5次；每次离心后去除上清，将沉淀分散至3mL无水乙醇中，避光保存。

5.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述信号探针为5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。

6.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述信号探针的制备方法包括：将5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液即获得10μM的DNA探针溶液。

7.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述第一步具体包括如下过程：将1×10⁶个对数生长期的细胞用冰PBS缓冲液离心清洗若干次后分散至100μL RNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中，冰上孵育一段时间后，将裂解液以12000rpm，20min离心，取出上清即得端粒酶提取物。

8.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于：所述端粒酶引物序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。