[发明专利]植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。本发明所提供的植物细胞质弹状病毒表达载体为含有大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)全基因组反向互补链的载体。本发明首次提供一种构建虫传植物病毒侵染性克隆的策略，即通过将前述表达载体与表达BYSMV的核衣壳(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)等病毒元件的载体经农杆菌介导在本生烟建立侵染性病毒，再利用本生烟发病汁液通过飞虱类昆虫接种单子叶植物并建立系统性侵染。不仅如此，本发明还进一步提供了所述植物细胞质弹状病毒表达载体在单子叶植物或飞虱类昆虫体内进行蛋白高效表达或者基因编辑等方面的广泛应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

植物基因工程中利用植物具有合成、折叠以及翻译后修饰等优势，用植物可以低成本地大量生产外源蛋白，例如疫苗抗原，抗体以及药用蛋白等。最常用的方法是利用转基因技术将外源蛋白的基因整合到植物基因组中，可以持续不断地表达外源蛋白。这种稳定转化的方法表达量一般较低，并且转基因过程比较费时费力，还有一些单子叶作物遗传转化非常困难，这些因素严重影响了利用转基因植物作为生物反应器的产业化进程。

从上世纪80年代开始，科学家开始探索利用植物病毒载体高效表达外源基因，其基本过程是在植物病毒侵染性克隆的基础上，对其病毒基因组进行基因操作，可以将目的基因导入到病毒载体中，随着病毒侵染寄主细胞增殖时大量表达外源蛋白。与基因遗传稳定转化相比，病毒载体导入过程简单，不需要人为直接地将目的基因插入植物染色体上，因此从构建到表达的周期短；此外，由于病毒在寄主细胞的大量增殖，表达的外源蛋白也随之增加，一般比稳定转基因高数百倍。目前构建的病毒表达载体在外源蛋白表达、功能基因组研究以及其他领域应用都发挥重要的作用。

目前，植物病毒表达载体主要以正链RNA病毒的使用较为广泛，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)，马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)，烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)，狼尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus，FoMV)，豇豆花叶病毒(Cowpeamosaic virus，CPMV)，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)。然而，以上述正链RNA病毒为基础的病毒表达载体的稳定性较差，病毒表达载体中插入的外源基因一般小于500bp，最长不超过1000bp，一旦超过此范围，外源片段极易丢失。病毒表达载体的接种方法一般通过农杆菌浸润技术，且一般在双子叶植物上具有较好的效果，在大多数单子叶植物上很难利用农杆菌浸润技术。

不仅如此，昆虫中的表达载体目前都是利用杆状病毒表达载体，主要是在鳞翅目昆虫或者其细胞系中表达外源蛋白。但对于半翅目的昆虫，目前还有没有能在成虫中表达外源蛋白的有效表达载体，严重阻碍了半翅目昆虫的研究进展和科学防治。

植物弹状病毒是负链RNA病毒，2015年，苦苣菜黄网弹状病毒 (Sonchus yellownet rhabdovirus，SYNV)的侵染性克隆首先被报道，是第一个植物负链病毒的侵染性克隆，也为其他负链病毒的构建提供参考(Jackson and Li，2016；Wang et al.，2015)。然而，苦苣菜黄网弹状病毒(SYNV)通过蚜虫传播，主要侵染双子叶植物，不能侵染单子叶植物和飞虱类昆虫，因此不能作为单子叶农作物和飞虱类农业昆虫的表达载体。

因此，亟需研究并开发一种可侵染单子叶植物和飞虱类昆虫，并且可表达大片段外源蛋白的植物病毒表达载体，克服目前植物病毒表达载体在应用方面的局限性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物细胞质弹状病毒侵染性克隆、表达载体及其构建方法与应用。