[发明专利]一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法

说明书

本发明提供了一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，其包括如下步骤：切取樟叶越桔组培苗叶片，将叶片正面划上伤口，叶片背面紧贴培养基，暗培养10～20d后，进行光培养；培养温度为25±2℃、光照强度为1500lx、光培养12h/d；接种于含有诱导剂的WPM(改良)培养基中，所述诱导剂为IBA、NAA或者IBA+NAA的混合物；其中，IBA的浓度为0.3～1.0mg/L，NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，IBA+NAA的浓度为0.3～1.0mg/L+0.1～0.5mg/L。本发明培养根的方法不仅具备繁殖速度快、不受季节限制等诸多优点，更明显的优势是无需经过愈伤诱导环节，叶片直接产生不定根，大大缩短了培养周期。

技术领域

本发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法。

背景技术

樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)常绿灌木，主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东。其果实营养丰富，全株具有舒筋活络、祛风除湿等功效，具有较高的药用和保健价值。此外，樟叶越桔也是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其主要成分的黑色素生成抑制活性优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可作为熊果苷天然替代资源加以开发利用。樟叶越桔目前仍处于野生状态，由于连年遭受破坏性采摘，导致其野生资源急剧减少，因此利用生物技术手段建立其培养体系具有重要意义。

不定根的组织培养由于生长速率快和次生代谢产物生产能力稳定而成为有效的植物组织培养方法。由于大部分药用植物产生的有用此生带产物均来源于根部且培养细胞只有达到一定的分化程度，次生代谢才被活化，所以采用不定根培养对药用植物中次生代谢产物的积累具有特殊的意义。不定根可作为培养有效次生代谢产物的可持续资源。

近年来，我国学者相继先后开展了一些药用植物如丹参(Salvia miltiorrhiza)、三七(Panax notoginseng)、苍术(Atractylodes lancea)、金铁锁(Psammosilenetunicoides)、太子参(Pseudostellaria heterophylla和轮叶党参(Codonopsislanceolata)等的不定根研究，如柴素真“柴素真.一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法.中国发明专利,2013,ZL201210293609.3.”通过金铁锁茎段诱导出愈伤组织，再以愈伤组织为外植体诱导不定根，发现不定根中的总皂苷含量约为金铁锁原药材的2倍。近年的文献报道发现，同属植物蓝莓的组培苗试管内生根较慢，生根率低，而组培苗试管外生根则相对延长了驯化移栽成活时间，且对技术人员要求更高，需具备更好的管理经验。宋刚等“蓝莓试管苗不定根的诱导研究.江苏农业科学,2011,39(6):89-91.”研究了暗处理对蓝莓试管苗诱导不定根的影响，其研究结果表明蓝莓组培苗瓶内生根困难，发根周期且生根率低；和加卫等“云南越桔的组织培养.植物生理通讯，2007,43(2):320.”研究表明以1/2WPM+NAA 0.05的生根培养基，5周后基本可长处2～4条1.0～1.cm长的不定根，生根率78％。

发明内容

本发明旨在提供一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，该方法无需进行愈伤组织诱导，利于降低生产成本，提高效率，为樟叶越桔多种次生代谢产物的生产提供指导依据。

本发明的上述目的是以下述方法加以实现的：

一种诱导樟叶越桔组培苗叶片直接生成不定根的方法，该方法包括如下步骤：将樟叶越桔叶片的正面划上与叶脉垂直的伤口，叶片的背面紧贴培养基，接种于添加诱导剂的培养基中，先暗培养，后进行光培养，培养温度为25±2℃、光照强度为1500lx，光培养的时间为12h/d，总计培养时间为30d。

根据所述的方法，其中所述的培养基为下表所示的改良WPM，

表 改良WPM固体培养基配方