[发明专利]玉米小斑病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用

说明书

本发明提供了一种玉米小斑病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用，专用于玉米小斑病菌的特异性检测，属于农作物病害检测和生物技术领域。本发明设计了一种玉米小斑病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，见序列表。基于该引物建立的玉米小斑病菌可视化检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现玉米小斑病菌的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为玉米小斑病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种玉米小斑病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用，专用于玉米小斑病菌的快速可视化检测，同时可实现田间玉米小斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定、防治及生物技术领域。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物、经济作物，还具有能源、饲料、果蔬等多种用途，是种植面积居首位、产量居次席的农作物，需求量极大。玉米产业健康发展对改善我国农业产业结构，保障粮食安全具有十分积极的重要作用。玉米小斑病是由平脐蠕孢属玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)侵染引起的叶部真菌病害。在充足水分或者高湿条件下，玉米小斑病病情迅速扩展，在玉米孕穗期以及抽穗期遇降水多、湿度高，光照时数少的天气情况下小斑病容易大流行，己成为玉米生产的主要病害。堆放在田间的玉米秸秆，遗留的玉米病叶、玉米苞叶都是来年发病的初侵染源。越冬的病原菌在来年遇到适宜温湿度等气候条件，便产生大量的分生孢子，并且借助气流或者雨水传播到田间生长的玉米叶片上，形成病斑，之后病斑产生大量分生孢子，又借助气流传播，对田间生长的玉米进行反复侵染，造成病害爆发流行，玉米上小斑病的潜育期为4d-6d，显症期大约为7d，玉米发病初期的化学防治是治理玉米小斑病的主要防治措施，而小斑病菌侵染初期难以从症状上与弯孢霉叶斑病、圆斑病及大斑病区分，且以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差。病害发生时常因难以做到病害及时检测而错过最佳防治时期，不能有效控制病原菌的传播和病害流行。而玉米小斑病菌在形态特征上与玉米大斑病菌极其相似，难以鉴定，因此迫切需要建立一种快速、灵敏的检测方法用于玉米小斑病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。

随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，PCR(polymerase chain reaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比不同的PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。

发明内容

针对现有技术中对玉米小斑病菌的检测和鉴定程序繁琐、耗时长、对鉴定经验要求高、准确度低，PCR检测需要依靠扩增仪等设备的问题，本发明提供了一种玉米小斑病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种玉米小斑病菌LAMP检测引物，所述玉米小斑病菌LAMP检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，各引物核苷酸序列为：

F3：5’-ACCACTGGTATCGTCCTCG-3’；

B3：5’-GCAGAGCTTCTCCTTGATGT-3’；