[发明专利]用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。所述引物组合包括核苷酸序列如Seq ID No.1‑40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异。其中每一对引物用于扩增MITF基因中的一个区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同，来源于不同区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列彼此不同。本发明的检测方法，采用所述20对引物特异性扩增样品中MITF基因的不同区域，利用UMI对扩增产物的二代测序数据进行降噪，从而准确检测出低拷贝数变异。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于无创检测MITF基因突变的引物组合及检测方法。

背景技术

基因突变的检测对于许多种肿瘤检测，胎儿遗传状态检测都具有重要的价值。目前针对胎儿的基因突变筛查，主要基于SNP array等多个平台系统，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析，成本昂贵；而常规依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，发生的碱基错误造成测序噪声，因此常规文库捕获和高通量测序不能解决由扩增和测序造成的变异检测偏差；而较新的循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)受其环化文库效率和背靠背引物位点的设计的影响。

孕妇外周血中胎儿来源的游离DNA的发现，为无创性检测胎儿遗传状态提供了可能。孕妇外周血cfDNA源于母亲和胎儿，胎儿游离DNA(cffDNA)来源于胎盘滋养层细胞，约占总cfDNA的10-20％，片段长度为140-180bp左右。将cffDNA从母亲来源的DNA中鉴别出来仍然是目前的技术难点，特别是如何检测母血血浆中cffDNA所导致的等位基因比例不平衡。目前国际上对cffDNA的研究主要通过位点特异性PCR，MALDI-TOF质谱法，数字PCR和高通量测序等方法进行。

目前主流的无创产前检测方法均基于胎儿变异位点检测和单体型检测：通过对母血血浆中cfDNA进行位点检测，然后利用相对变异剂量(RMD)和相对单体型剂量(RHDO)分析孕妇血浆中胎儿变异位点和单体型的相对含量。通过仅存在父亲中的SNP推导了父源部分的胎儿基因组，母亲来源的胎儿基因组部分则使用父亲纯合但母亲杂合的SNP进行推导。Papasavva等利用该方法对母血cfDNA进行分析，成功对其cffDNA基因型和变异位点进行分析。因此利用对cffDNA中变异位点和单体型的检测，可有效地提高胎儿致病基因的诊断准确度。

MITF(Microphthalmia-associtated transcription factor)基因(NCBI：mRNA序列号为NM_00248)全长4490bp，其中ORF编码序列为1260bp，共有9个外显子。其编码蛋白是小眼畸形相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用，同时还参与了肥大细胞、破骨细胞和眼色素上皮细胞的发育和分化。MITF基因突变在临床上会导致综合征性耳聋，主要表现为感音神经性聋及色素异常，后者包括虹膜异色、白额发、早白发、皮肤色素减退或雀斑沉着；其他表现还有内眦异位、高宽鼻根、多毛症、一字眉或眉毛中部潮红等。利用基因检测早期发现，早期干预，从而达到防残减残，提高人口素质的目的，对减轻患者家庭和社会的负担意义重大。

因此，有必要针对MITF基因开发一种更加便捷和可靠的适合无创检测低拷贝数基因突变的技术。

发明内容

根据上述领域存在的需求，发明人研发了一种无创检测MITF基因突变的方法，在常规的多重扩增基础上，向扩增引物中引入UMI(Unique Molecular Identifier)分子标签，利用UMI对二代测序数据进行降噪，从而准确地检测低拷贝数变异。

本发明请求保护的技术方案如下：

用于无创检测MITF基因突变的引物组合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20对引物，用于特异性扩增MITF基因的不同区域，从而同时检测MITF基因的变异及其临近SNP位点。