[发明专利]一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒。该方法依次包括如下步骤：取肿瘤细胞，接种至诱导培养基，贴壁培养3d～5d；接种至肿瘤细胞球培养基，贴壁培养1d～3d；接种至肿瘤细胞球培养基，悬浮培养，得到肿瘤干细胞；诱导培养基中含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和HDAC抑制剂；肿瘤细胞球培养基为含有青霉素、链霉素和B27培养基添加剂的mTeSR培养基。实验证明，采用本发明提供的方法制备的肿瘤干细胞高表达Oct4、Nanog和CD133，生长缓慢，且具有外排Hoechst、耐受化疗药物等生物学特性，完全获得了肿瘤干细胞的特征。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒。

背景技术

胰腺癌是一种高度致命性消化道恶性肿瘤，恶性程度高，转移和复发率高，预后差。由于胰腺癌早期缺乏典型的临床表现，确诊时往往已经进入晚期，再加上胰腺癌对化疗药物不敏感，广泛耐药，尽管近几年在胰腺癌的医疗诊断和手术治疗方面都取得了一定进展，但胰腺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。

研究证实，在血液恶性肿瘤和包括胰腺癌在内的实体瘤中存在肿瘤干细胞(CSCs)，肿瘤干细胞在肿瘤复发中起着至关重要的作用。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤存在异质性，肿瘤内存在一小部分能够自我更新，多效分化，高致瘤性以及对放疗化疗具有抵抗能力的癌细胞，其余大部分细胞失去生长分化潜能，没有或者只有有限的增殖分化能力，经过短暂的分化后最终死亡。肿瘤干细胞学说为胰腺癌发病机制和治疗策略的研究提供了新的依据，只有清除肿瘤干细胞才能根治恶性肿瘤，否则残存的肿瘤干细胞依然会导致肿瘤的复发，以前对于胰腺癌的研究忽略了肿瘤干细胞的存在，目前采取的治疗方法不能有效的清除胰腺癌中的肿瘤干细胞，这或许是导致胰腺癌治疗失败，肿瘤转移复发的根本原因。目前认为消除肿瘤干细胞是获得癌症永久性治愈的重要策略。肿瘤干细胞的发现和研究为癌症的研究和治疗带来了新的方向。

2007年，Li等将人原发胰腺癌标本种植于非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下，对第一代及传代后的肿瘤细胞进行标记，通过流式分选技术分选出0.2％-0.8％CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞，该亚群细胞在NOD/SCID小鼠体内具有高致瘤性，其致瘤能力是CD24^-CD44^-ESA^-细胞的100倍。此外，将分离出的CD44⁺CD24⁺ESA⁺细胞进行连续传代成瘤实验发现，其肿瘤组织中CD44⁺CD24⁺ESA⁺细胞比例与其来源的人胰腺癌组织相似，说明CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞具有自我更新能力，证实了胰腺癌干细胞的存在。2007年，Hermann等发现，在胰腺癌细胞中有1％-3％表达CD133⁺细胞亚群，其同样具有肿瘤干细胞的特性。之后，研究者发现通过细胞表面标志物c-Met和/或ALDH也可以分离得到胰腺癌干细胞。除了通过肿瘤干细胞的表面标志物的方法分离胰腺癌干细胞外，也有研究者根据胰腺癌干细胞的生物学特性分离胰腺癌干细胞。Hoechst33342是一种核酸荧光染料，在肿瘤干细胞中有一部分细胞可以外排这种染料，从而使细胞核不着色或着色程度很低，研究者将这类细胞称为侧群(side population，SP)细胞。Zhou等用流式细胞仪从人胰腺癌细胞系Panc1中分离出对Hoechst33342拒染的SP细胞，约占细胞总数的2.1-8.7％。也有研究者将人胰腺癌细胞系在含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、神经细胞存活因子-1(NSF-1)和N-乙酰半胱氨酸的CSC诱导培养基中培养，获得球形细胞后转移到层粘连蛋白包被的培养皿中,在含有B27培养基添加剂、BSA、EGF、bFGF的DMEM-F12基础培养基中培养约两个月，诱导细胞中CD24⁺CD44⁺ESA⁺的比例增加，诱导的细胞具有高致瘤性，细胞循环检测显示诱导细胞处于G0/G1期。2016年，Ning等将胰腺癌细胞在含有BFGF、EGF、B27培养基添加剂和胰岛素的DMEM-F12基础培养基中培养，发现胰腺癌细胞可聚集成球并表达胰腺癌干细胞的表面标志物，表明胰腺癌细胞在一定条件下可以转变为胰腺癌干细胞。由于肿瘤干细胞的表面标志物缺少特异性，而Hoechst33342具有毒性，因此现有方法分离获得的肿瘤干细胞含量少，限制了肿瘤干细胞的研究。由此可见，建立一种快速高效获得大量肿瘤干细胞的方法，对于肿瘤干细胞的深入研究以及开发针对肿瘤干细胞的靶向治疗具有重要的意义。