[发明专利]一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法

权利要求书

1.一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括质控线(1)、检测线(2)、吸水垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、纳米胶体碳释放垫(5)、样品垫(6)、PVC胶板(7)，其特征在于，所述质控线(1)是将抗ESA IgG喷于硝酸纤维素膜(4)形成，所述检测线(2)是将纯化ESA喷于硝酸纤维素膜(4)形成，检测线(2)和质控线(1)设置在硝酸纤维素膜(4)的两侧，硝酸纤维素膜(4)的上方两端分别为纳米胶体碳释放垫(5)和吸水垫(3)，纳米胶体碳释放垫(5)的上方为样品垫(6)，所述样品垫(6)、纳米胶体碳释放垫(5)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(3)从左至右依次排列并粘贴在PVC胶板(7)上。

2.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述样品垫(6)为玻璃纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述纳米胶体碳释放垫(5)为胶体碳溶液处理好的聚酯膜。

4.根据权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条，其特征在于，所述吸水垫(3)和硝酸纤维素膜(4)相接处重叠1.0-1.5mm，纳米胶体碳释放垫(5)与硝酸纤维素膜(4)相接处重叠1.0-1.5mm，所述样品垫(6)与纳米胶体碳释放垫(5)相接处重叠1.0-1.5mm。

5.如权利要求1所述的一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法，其特征在于，该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法具体包括以下步骤：

步骤一、弓形虫抗原ESA的制备：

从液氮中保存的弓形虫速殖子，放入到37℃水浴锅中解冻，大约5min融化后，用5mL灭菌生理盐水加入到融化后的1mL弓形虫速殖子保存液中，反复吹打混匀后5000rpm/min离心10min，离心后弃上清液，沉淀再加5mL的灭菌生理盐水充分混匀后以同样的速度离心，反复洗涤2～3次，最后用混有1000U抗生素的溶液洗涤管底，按每只小鼠0.2mL的剂量注入小鼠腹腔中，连续传代3次恢复虫株活性和毒力后，待小鼠发病时，用2mL灭菌生理盐水冲洗感染鼠的腹腔，收集腹腔洗液，3000rpm/min离心30min，收集上清镜检确定没有速殖子和小鼠腹腔细胞后冻于-20℃冰箱过夜，次日取冻存上清室温融化，3000rpm/min离心30min除去自凝物，收集上清即为ESA抗原；

经2.0荧光定量仪测定弓形虫抗原ESA蛋白浓度为1.56mg/mL，取50μLESA加入10μL5X Loading buffer充分混匀后于沸水中煮5-10min，然后将样品加入到聚丙烯酰胺凝胶的梳子孔内上样，进行SDS-PAGE电泳确定纯化的ESA结果；

步骤二、兔抗ESA血清的制备：

以纯化后的弓形虫ESA为抗原，免疫SPF新西兰大白兔，取纯化的ESA抗原0.5mL用生理盐水稀释，加入等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后，在家兔腿部肌肉、背部皮下进行注射，于第一次免疫后间隔2周再以0.5mLESA抗原加入等体积不完全弗氏佐剂充分乳化后在家兔背部、腿部皮下及肌肉进行注射，再间隔2周用与第二次相同的方法进行第三次免疫，采血测其效价，未达到要求，直接取0.5mLESA抗原用生理盐水稀释后注射进行加强免疫，最后在加强免疫后第10天采用心脏采血的方法采集血液，将采集的兔血放于37℃恒温箱中放置1h后4000rpm/min离心收集上清；

步骤三、兔抗ESA纯化抗体的浓度测定及SDS-PAGE检测；

用2.0荧光定量仪测定纯化后抗体蛋白浓度，然后通过SDS-PAGE电泳检测纯化后的抗体蛋白纯化情况；

步骤四、确定纳米胶体碳ESA溶液的最佳PH值及ESA的用量：

配置pH分别为4，5，6，7，8，9，10的磷酸盐缓冲溶液，加入纳米碳配成0.1％的悬液，再加入0.1％Triton-100，超声破碎仪工作6S，停3S，超声30min后，250rpm离心10min，弃沉淀，上清静置24h后，不出现沉淀的pH值即为最适pH值；

将兔抗ESA蛋白溶液进行系列稀释后，取0.2mL/20-100μg加入到1mL0.1％胶体碳溶液中，另设一管不加ESA做为空白对照，3h后加入100μL 氯化钠溶液，混匀后静置24h，不稳定的胶体碳溶液会发生沉淀，能使胶体碳溶液稳定的最小ESA用量再加10％即为最适兔抗ESA用量；

步骤五、纳米胶体碳母液的制备；

确定最佳标记pH，兔抗ESA用量之后，用涡旋振荡器充分混匀兔抗ESA碳标液，10℃摇床摇3h，使胶体碳与兔抗ESA充分接触，加入BSA使其终浓度为1％，再加入10％聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为0.2％，10℃摇床摇3h，然后将试管内液体以13000rpm/min的速度，4℃离心20min，弃上清，沉淀用含0.4％BSA、0.2％PEG的磷酸盐缓冲液(PB)悬浮，重复离心两次，沉淀以原体积1/10的碳标稀释液(含1％BSA、0.2％PEG、3％蔗糖、0.5％triton-100、0.5PVP)悬浮为母液，加入0.02％叠氮钠防腐，放于4℃冰箱备用；

步骤六、碳标ESA的制备：

聚酯膜和玻璃纤维素膜用0.05％的Tween-20浸泡后烘干备用，取出处理好的聚酯膜浸入标记好的碳标ESA胶体碳溶液中，于37℃干燥箱干燥后取出放于4℃备用；

步骤七、纳米胶体碳溶液最佳稀释倍数的确定：

分别将制备好的胶体碳母液稀释2倍、6倍、10倍、14倍，包被聚酯膜，37℃烘干后组装试纸条，检测条带和背景清晰的稀释倍数为最佳母液稀释倍数；

步骤八、试纸条的组装：

将抗ESA IgG和纯化ESA喷于硝酸纤维素膜(4)形成质控线(1)和检测线(2)，硝酸纤维素膜(4)的上方两端分别为纳米胶体碳释放垫(5)和吸水垫(3)，纳米胶体碳释放垫(5)的上方为样品垫(6)，以上所有部分都粘贴在PVC胶板(7)上，将板条切成0.5cm宽的小条，于4℃密封保存。