[发明专利]一种用于眼表损伤修复的细胞植片及其制备方法

权利要求书

1.一种用于眼表损伤修复的细胞植片，其特征在于：包括细胞膜片层（1）和纤维蛋白层（2）双层结构，所述细胞膜片层（1）为由5～7层上皮细胞排列构成的厚度为50μm～150μm的膜结构，所述纤维蛋白层（2）为由纤维蛋白胶形成的厚度为200μm～500μm的疏松多孔的膜结构。

2.按照权利要求1所述的一种用于眼表损伤修复的细胞植片及其制备方法，其特征在于：所述上皮细胞为角膜上皮细胞、口腔黏膜上皮细胞、羊膜上皮细胞和由间充质干细胞分化的上皮细胞中的一种或多种的混合物。

3.一种制备如权利要求1所述的细胞植片的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、细胞膜片层（1）的制备，具体过程为：

步骤101、将上皮细胞接种在Transwell小室中进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基并每两天换一次，培养15～20天后，细胞膜片形成；

步骤102、降低DMEM高糖培养基的液面至细胞膜片层（1）高度，进行气-液界面培养，每天换一次DMEM高糖培养基，7天后，倒置显微镜观察，形成了连续的上皮细胞层，细胞膜片层（1）培养结束；

步骤二、纤维蛋白层（2）的制备，具体过程为：

步骤201、去除Transwell小室中的DMEM高糖培养基后，再采用清洗液洗去残留的DMEM高糖培养基；

步骤202、使用物质的量浓度为40mmol/L的CaCl₂溶液配制浓度为20U/ml～100U/ml的凝血酶溶液；

步骤203、使用纯水配制质量-体积浓度为0.02g/ml～0.1g/ml的血纤维蛋白原溶液；步骤204、取步骤202中的凝血酶溶液0.5ml，步骤203中的血纤维蛋白原溶液0.5ml，将凝血酶溶液和血纤维蛋白原溶液同时均匀涂于细胞膜片层（1）上，等待2min～5min后，纤维蛋白胶凝固，纤维蛋白层（2）制备结束；

步骤三、将制备好的纤维蛋白层（2）与细胞膜片层（1）同时从Transwell小室的底面上缓慢揭下，制成了用于眼表损伤修复的细胞植片。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤101中所述Transwell小室的直径为12mm，将上皮细胞接种在Transwell小室中的接种密度为2×10⁴个/cm²～1×10⁵个/cm²。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤101中进行细胞膜片培养时是在温度为37℃、质量百分比浓度为5%的CO₂气氛条件下进行的。

6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤101中所述DMEM高糖培养基中含有质量百分比浓度为10%的胎牛血清、质量-体积浓度为30mg/ml～70mg/ml的维生素C、质量-体积浓度为2ng/ml～5ng/ml的表皮生长因子、质量-体积浓度为10μg/ml～30μg/ml的牛脑垂体提取物和质量-体积浓度为2ng/ml～5ng/ml的亚硒酸钠。

7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤201中所述清洗液为磷酸盐缓冲液。