[发明专利]检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父‑母‑已出生同胞三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿SNP位点相应的基因型。本发明通过目标区域捕获结合高通量测序技术，实现对地贫无创产前检测；所需的样本量少；该方法在对父源突变检测的基础上，可以实现对胎儿母源基因突变的检测。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒。

背景技术

地中海贫血(简称地贫)是全世界的高发遗传病之一，是由于人体α，β-珠蛋白基因突变或者缺失而导致α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫，α-地贫相关基因为HBA2和HBA1，β-地贫相关基因为HBB。地贫集中在热带和亚热带地区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和香港等地受累人口超过2亿。目前地贫尚无根治的方法，只能使用输血治疗或脊髓移植，其价格昂贵且彻底治愈几率不高，因此产前筛查和诊断对预防该种出生缺陷疾病具有重大意义。

目前临床报道产前检测地贫基因突变的方法有几种：传统的羊膜穿刺、腹绒毛活检等，这些有创伤性的操作可能导致胎儿损伤、流产或宫内感染等。1997年，卢煜明发现孕妇外周血浆中存在来自于胎儿的游离DNA，这一发现为通过孕妇外周血无创产前诊断和检测胚胎基因型提供了新的可能。已有报道利用孕妇血浆游离DNA与质谱、数字PCR、COLD-PCR等技术对地贫已成功进行无创检测。但这些方法是基于单一位点的PCR技术，由于血浆DNA含量低及高度片段化的特点，很可能会带来PCR的假阴性。除此以外，这些方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定母源突变的存在情况。

随着高通量测序技术的应用，孕妇血浆DNA无创产前检测胚胎染色体异常(如21、18、13染色体非整倍体变异)以及部分大的拷贝数变异已经成功应用于临床产前筛查和诊断。进一步地，通过高通量测序技术实现检测胎儿的家系中(指胎儿的父亲和母亲)基因型和单倍体型后，对孕妇血浆游离DNA的目标区域高通量测序，通过RHDO和SPRT等生物信息学方法实现对胎儿是否携带地贫相关基因变异的检测。高通量测序技术具有准确度高、通量大、样本需求量少、可以产生大量数据的特点。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高精确度的无创产前胎儿地中海贫血致病基因的检测方法，该方法不仅能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，还可以进一步确定母源突变的是否存在。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，所述SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父-母-已出生同胞(指胎儿的姐姐或哥哥)三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建所述地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿所述SNP位点相应的基因型。