[发明专利]一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂

说明书

本发明公开了一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂。该外泌体的制备方法包括：步骤一：将不含外泌体血清的培养基加入到骨髓间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液，进行外泌体的提取；步骤二：去除所述上清液中的细胞碎片、死细胞和杂质；去除上清液后加入磷酸缓冲盐溶液PBS溶解收集外泌体沉淀，使用无菌滤膜过滤，并将所得的所述外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用。该方法通过体外实验证明早代的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体与人脐带间充质干细胞共培养可显著促进间充质干细胞的增殖活性及相关功能，是潜在改善大规模细胞培养过程中细胞功能的有效策略。

技术领域

本发明实施例涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）是一类具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞，经诱导后可以分化为多种组织和细胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反应，是再生医学中一种较为理想的种子细胞。

脐带间充质干细胞（Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs）作为一种组织来源的间充质干细胞，具有更强的分化潜能和增殖能力。值得注意的是，大量传代培养以后，有些细胞仍能保持其多潜能性，而有些细胞则向特定的方向分化或者开始衰老，即生长速度逐渐变慢，细胞形态也由长梭形变的扁平粗大，进而失去临床上的使用价值，使用于细胞治疗的脐带间充质干细胞数量非常有限。因此，申请人设想，采用一种细胞分泌的成分作为添加物，维持人脐带间充质干细胞的增值和存活，便于维持其功能的正常发挥。

同时，实验室中通常在培养基中添加胎牛血清(FBS)来促进脐带间充质干细胞的生长，但是该方法增加了收获细胞携带病原体、异种抗原的可能性，并常常导致各批细胞间不稳定因素产生。美国FDA命令禁止将FBS培养的细胞用于细胞治疗。因此，寻找新的可应用于临床细胞治疗的UC-MSCs培养基添加物具有重要的应用价值。

外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，包括肿瘤细胞在内的几乎所有细胞类型都可以产生并释放外泌体。外泌体可以保护多种生物活性物质在细胞外环境中不被降解和稀释，并且可以促进这些物质通过组织液或血液的远距离输送，同时外泌体膜上特异性的表面配体允许它与受体细胞高效率结合，将生物分子传递给靶细胞。外泌体作为干细胞分泌物中的重要成分之前也有相关报道，但目前还没有将其用于维持大规模细胞扩增。

发明内容

本发明提供一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂，通过体外实验证明早代的骨髓间充质干细胞分泌的外泌体与人脐带间充质干细胞共培养可显著促进间充质干细胞的增殖活性及相关功能，是潜在改善大规模细胞培养过程中细胞功能的有效策略。

第一方面，本发明实施例提供了一种外泌体的制备方法，包括：

步骤一、骨髓间充质干细胞上清的制备：将不含外泌体血清的培养基加入到骨髓间充质干细胞中，将其稀释成细胞悬液接种于细胞培养瓶中培养，收取培养后的上清液，进行外泌体的提取；

步骤二、骨髓间充质干细胞外泌体的分离存化：去除所述上清液中的细胞碎片、死细胞和杂质；去除上清液后加入磷酸缓冲盐溶液PBS溶解收集外泌体沉淀，使用无菌滤膜过滤，并将所得的所述外泌体沉淀分装于无菌离心管中，保存备用。

进一步地，所述步骤一，具体包括：

采用2-4代骨髓间充质干细胞，将10mL不含外泌体血清的培养基加入到所述骨髓间充质干细胞中，将其稀释成1×10⁶浓度的细胞悬液接种于25cm³的细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、湿度饱和的培养箱中培养36-72h时收取细胞培养后的上清液，收集达到200ml以上，进行外泌体的提取。

进一步地，所述步骤二，具体包括：