[发明专利]一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团。本发明以人类PAX1基因甲基化突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地测PAX1基因甲基化突变，且对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品所获得的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

在宫颈肿瘤细胞中，PAX1基因(配对盒家族基因1)启动子发生甲基化后会造成基因沉默或失活，从而使抑癌基因PAX1失去活性，这一点已得到国际上的广泛认可。不仅如此，根据国际多项研究证实，重度癌前病变或宫颈癌患者其局部区域的配对盒家族基因1(PAX1基因)启动子区域的CpG岛(CpG island)甲基化程度会异常升高，导致宫颈癌变现象产生，此基因高度甲基化造成细胞功能发生重大改变，因而可做为目前TCT 与HPV检测结果的癌化转变监测。Lai等在2008年发现配对盒基因(Paired box 1， PAX1)在宫颈癌中具有高甲基化表现，数年间研究已有十多篇国际文献报导。许多文献验证PAX1基因具有筛查的临床意义。同样的，Huang等在2010年发现PAX1在宫颈癌组织中具有94.4％与100％高度甲基化现象。2010年Lai研究PAX1具有78％敏感性与91％特异性；在2014年Kan文章中也验证PAX1具有86％敏感性与85％特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测人类PAX1基因甲基化突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括一第一检测引物对、一第一检测探针、一第二检测引物对和一第二检测探针；第一检测探针的5’端修饰有第一荧光报告基团，3’端修饰有第一荧光猝灭基团；第二检测探针的5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端修饰有第二荧光猝灭基团；其中

第一检测引物对由PAX1-F和PAX1-R组成，依次包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列；第一检测探针为PAX1-P，包括如SEQ ID NO 03所示的序列；

第二检测引物对由ACTB-F和ACTB-R组成，依次包括如SEQ ID NO 04和05所示的序列；第二检测探针为ACTB-P，包括如SEQ ID NO 06所示的序列；

该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的组成如下：第一检测引物对、第二检测引物对、第一检测探针、第二检测探针、1×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq酶、模板和H₂O；

上述模板的DNA甲基化位点通过亚硫酸盐处理液进行了转化；

该多重荧光PCR检测试剂盒的反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，56℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，56℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。

在本发明的一个优选实施方案中，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ1。

进一步优选的，所述PAX1-F如SEQ ID NO 01所示。

进一步优选的，所述PAX1-R如SEQ ID NO 02所示。